[理化生]22动物细胞工程.ppt

,专题2.2 动物细胞工程,知识目标：,1、简述动物细胞培养的过程 2、动物细胞培养的特点 3、细胞株与细胞系的区别 4、动物细胞培养的条件 5、简述动物细胞培养的应用 6、图示体细胞核移植的过程 7、体细胞核移植选什么作受体细胞？为什么？,知识目标：,8、促进动物细胞融合的方法？ 9、单克隆抗体的制备过程 10、传统抗体与单克隆抗体的特点 11、杂交瘤细胞的特点 12、10代以内的传代细胞具有什么特点？,动物细胞工程的基本技术,一、动物细胞培养,1、概念：就是从动物机体中取出相应的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,2、过程 取材：选取动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（分裂能力强） 分散成单个细胞： 用胰蛋白酶(PH:8-9)或胶原蛋白酶,一、动物细胞培养,2、过程 制成细胞悬液： 用培养液将分散的细胞制成细胞悬液； 原代细胞培养： 动物组织消化后的初次培养；,一、动物细胞培养,2、过程 传代细胞培养： 贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，让细胞继续增殖； 10代以内的细胞能保持正常的二倍体核型；,一、动物细胞培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,40-50代细胞,传代培养,细胞株,无限传代,细胞系,单个细胞,加培养液,3、动物细胞培养过程的基本概念 细胞贴壁：细胞在培养过程中，分散的细胞贴附在瓶壁上。 接触抑制：贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖；,一、动物细胞培养,细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,贴壁生长、接触抵制,细胞贴壁过程,3、动物细胞培养过程的基本概念 细胞株： 细胞在传代培养中，传到10代左右就不容易传下去，少数细胞度过危机可继续传下去，这些存活细胞能传4050代，这种传代细胞叫细胞株，其遗传物质没有改变。,一、动物细胞培养,3、动物细胞培养过程的基本概念 细胞系： 极少数细胞株细胞度过危机，遗传物质改变，带有癌细胞特点，可无限制的传下去，这部分细胞叫细胞系。,一、动物细胞培养,(1)为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,答： 因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。,讨论（过程）,(2)为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,答：成块组织中细胞与细胞靠在一起，限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。,讨论（过程）,(3)胰蛋白酶的作用是什么？由此可说明细胞间的物质是什么成份？ 能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,答：催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质(胶原蛋白等) 。 不能。因为两者的最适pH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适pH较接近。,讨论（过程）,4、动物细胞培养条件 无菌、无毒环境 可以培养基中加一些抗生素，以防培养过程的污染； 定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害；,一、动物细胞培养,4、动物细胞培养条件 营养条件 水、无机盐、碳源（糖）、氮源（氨基酸）、生长因子等； 可加血清、血浆等天然成分。,一、动物细胞培养,4、动物细胞培养条件 温度和PH值 36.50.5OC 7.27.4PH,一、动物细胞培养,4、动物细胞培养条件 气体环境 95%氧气:细胞代谢所需; 5%二氧化碳:维持培养液的PH值;,一、动物细胞培养,5、实际应用 大规模生产生物制品; 基因工程的受体细胞; 培养的动物细胞用于检测有毒物质; 培养正常或病变细胞，用于生理、药理、病理研究;,一、动物细胞培养,获得细胞,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,或细胞分泌蛋白,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物组织培养和动物细胞培养的比较,1、动物细胞核移植技术的概念 动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经失去细胞核的卵母细胞中,使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育成为动物个体;,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,2、克隆动物的概念 用核移植方法得到的动物称为克隆动物;,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,3、核移植的种类 胚胎细胞核移植:细胞分化程度低，恢复全能性容易; 体细胞核移植;细胞分化程度高，恢复全能性困难;,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,4、体细胞核移植的过程,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,去核卵母细胞,供体体细胞,重组细胞,重组胚胎,克隆动物,代孕母牛C,卵母细胞培养至减中,供体细胞培养,高产奶牛A,供卵奶牛B,物理或化学方法激合受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。,注入，刺激使细胞融合,胚胎移植技术,(4)为什么体细胞核移植技术要选M期的卵母细胞作为受体细胞？,答： 因为M期的卵母细胞体积大，易操作，含有促使细胞核全能性表达的物质和营养条件。,讨论（过程）,5、体细胞核移植技术的应用前景,在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程； 保护濒危物种； 生产医用蛋白质及组织器官移植的供体；,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,6、体细胞核移植技术存在的问题,成功率低； 克隆动物畸形率、死亡率高，易出现早衰等问题； 食品安全性问题；,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,三、动物细胞融合,1、概念：也叫细胞杂交，指两个或多个动物细胞结合成一个细胞的过程。整合后的细胞叫杂交细胞。,三、动物细胞融合,2、细胞融合方法：,物理方法：离心、电刺激、振动 化学方法： PEG（聚乙二醇） 生物方法：灭活的病毒 灭活的含义P52资料卡,四、动物细胞融合,细胞核,病毒颗粒,细胞核,灭活的病毒与细胞膜上的糖蛋白作用，使细胞相互融合。,细胞膜上的糖蛋白分子和脂质重新排布,细胞膜打开,细胞融合，形成杂种细胞,三、动物细胞融合,3、细胞融合意义：,突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；,植物、动物细胞融合的比较,四、单克隆抗体的制备,生产：注射抗原从动物血清中分离 问题：抗体产量低、纯度低、特异性差；,、传统抗体生产及特点,四、单克隆抗体的制备,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体 动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用； 每一个淋巴细胞只能产生一种抗体；,、B淋巴细胞与抗体的关系,四、单克隆抗体的制备,3、单克隆抗体的制备 思路： 克隆单一的浆细胞成为细胞群，同时解浆细胞不能无限增殖的问题将浆细胞与骨髓瘤细胞融合；,四、单克隆抗体的制备,3、单克隆抗体的制备 过程,小鼠注射抗原,四、单克隆抗体的制备,3、单克隆抗体的制备 单克隆抗体的特点： 特异性强、灵敏度高、可大量生产 单克隆抗体的原理：,免疫原理 细胞融合原理 动物细胞培养原理,四、单克隆抗体的制备,3、单克隆抗体的制备 应用,作为诊断试剂 用于治疗疾病和运载药物,四、单克隆抗体的制备,3、单克隆抗体的制备 杂交瘤细胞的特点： 既能无限增殖，又能产生特异性抗体；,参考资料,HAT选择性培养基,在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。,DNA分子复制的两条途径,1、D途径： 即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而hat培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断dna合成的“d途径”； 2、S途径： 是应急途径或补救途径（“s途径”），它是利用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（hgprt）和胸腺嘧啶核苷激酶（tk）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。,不同细胞的DNA合成途径,1、效应b细胞和两个效应b细胞融合细胞：具有D和S途径，“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“