《理学酶工程》PPT课件.pptVIP

2019/5/4,1,第二章 酶工程,2019/5/4,2,酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，是在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。它的应用主要集中于食品工业、轻工业、医药工业和环保等领域。,2019/5/4,3,酶工程的内容,（1）对天然酶的开发和生产（包括微生物酶的发酵和提取以及从动植物中提取酶的技术）、包括酶的分离纯化及鉴定技术； （2）酶分子的修饰技术，人工设计及与其他生物技术领域的交叉和渗透。 （3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； （4）酶反应器的研制和应用； 其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。,2019/5/4,4,一、酶的基础知识,1.定义： （Enzyme proteins）酶是由生物体产生的具有催化剂活性的蛋白质。,高效率：比非酶催化高1071013倍 高度专一性 反应条件温和 酶催化是可调控的,2.酶的催化特性,2019/5/4,5,4.酶促反应的影响因素及动力学,1.温度 2.pH值 基质浓度 4. 酶的总浓度E0 5. 毒物或抑制剂,2019/5/4,6,一、酶制剂的生产,2019/5/4,7,（一）酶的提取与分离纯化 目的：把酶从生物体中提取出来，使之与杂质分开而达到与使用目的相适应的纯度；防酶变性失活。,1.酶生产原料选择 （1）对酶源的要求 1）酶含量丰富 2）提取、纯化方便 （2）微生物作为酶的优势 1）易得到所需的酶类 2）易获得高产菌株 3）生产成本低 4）微生物生长周期短 5）提高微生物产酶能力的途径较多,2019/5/4,8,（3）对酶生产菌的要求 1）不是致病菌，也不产毒素 2）不易变异退化，不易感染噬菌体 3）产酶量高，而且最好产生胞外酶 4）原料廉价，周期短，易培养,2019/5/4,9,2.酶生物原料预处理(酶的提取） 胞外酶：直接从发酵液中提取； 胞内酶：需破碎细胞。 破碎细胞的方法： 动植物细胞常用高速组织捣碎机和组织匀浆器破碎； 微生物细胞的破碎则有机械破碎法、酶法、化学试剂法和物理破碎法等多种。,JY92-II D超声波 细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,2019/5/4,10,一种新型的微生物酶纯化手段制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 (未被广泛应用于酶的制备),3、酶的生产及分离纯化,2019/5/4,11,酶分离纯化常用方法,2019/5/4,12,酶分离提纯步骤如下：,2019/5/4,13,2019/5/4,14,（1）酶分离的沉淀技术 1）盐析溶解度的差异,向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl，当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。 盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，复可溶解。,2019/5/4,15,等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解盐溶 原因？,盐溶盐析,2019/5/4,16,盐析,向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？,当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。,2019/5/4,17,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%饱和度,饱和,析出,析出,分段盐析,分子量越大，沉淀所需盐的量越少；,2019/5/4,18,2）PEG沉淀法溶解度的差异 空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。 PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。,2019/5/4,19,3)有机溶剂沉淀法溶解度的差异 与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。,室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却至0以下，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。,2019/5/4,20,4）等电点沉淀法溶解度的差异 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 一般用于酶的粗分离。,2019/5/4,21,5）热变性沉淀法热稳定性的差异 适用于热稳定性酶。通过控制T，使大量杂质蛋白变性除去。 可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。,2019/5/4,22,（2）层析分离 是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数）的不同，使各组分的分布程度不同而达到分离。 1）凝胶过滤层析：分离酶蛋白时，分子大小大于凝胶孔径的蛋白被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的分子蛋白就被分开了。,2019/5/4,23,Gel Filtration.swf,2019/5/4,24,2019/5/4,25,原理:不同蛋白质等电点不同,在同一pH介质中电离情况不同，分子所带电荷不同,与离子交换剂的吸附能力不同. 将离子交换树脂装入层析柱。 带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质.,2）离子交换层析法,Ion Exchange,2019/5/4,26,2019/5/4,27,离子交换层析的基本原理,物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,2019/5/4,28,原理：利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。 将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结合的物质再用洗脱剂把它从柱上洗脱下来。,3） 亲和层析法,2019/5/4,29,利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,亲和色谱颗粒,具有极强的专一性,2019/5/4,31,Affinity,2019/5/4,32,4） 高效液相色谱层析（HPLC）,特点： 使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。,2019/5/4,33,通过高压泵，连续的将流动相按一定流速流过柱子，通过进样器注入样品混合物。混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。,2019/5/4,34,（3）酶分离纯化的电泳技术,电泳在外电场作用下，由于蛋白质所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。 区带电泳样品溶液在一惰性支持物上进行电泳的过程。电泳后，不同的蛋白质组成被分离形成带状区间。区带的位置可用专一蛋白质染料染色显示，有些也可利用伴有颜色变化的酶催化反应来显示。,2019/5/4,35,在蛋白质组学中对电泳的分类,一维电泳(one dimensional gel electrophoresis, 1DE)，现在普遍采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)，又称双向电泳,2019/5/4,36,非变性电泳(native PAGE)： 迁移率由分子大小、分子形状、净电荷多少决定。 SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳） 在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质分子被大量SDS阴离子包裹，消除了它们间原来携带的电荷差别，电泳时蛋白质向正极移动。因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小，故广泛用于蛋白质分子量的测定。,一维电泳,2019/5/4,37,支持物：聚丙烯酰胺凝胶。具有分子筛的作用。 凝胶的孔隙大小通过适宜的浓度和加入交联剂（亚甲基双丙烯酰胺）加以控制,2019/5/4,38,电泳条带,2019/5/4,39,水平板式电泳槽,2019/5/4,40,PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类， 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,2019/5/4,41,浓度梯度凝胶电泳 从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为5，底部凝胶浓度为25。 梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。 另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。,2019/5/4,42,等 电 聚 焦 电 泳IEFE Isoelectric Focusing Electrophoresis,IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。,2019/5/4,43,在正端吸入酸，如硫酸、磷酸或醋酸，在负极引入碱，如氢氧化钠、氨水等,2019/5/4,44,常用支持介质：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，其中聚丙烯酰胺凝胶最常用 载体两性电解质:一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度，是一种特殊的缓冲液。,pH范围：pH310,2019/5/4,45,没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。,2019/5/4,46,引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。,2019/5/4,47,基本原理 蛋白质分子在不同pH下的解离状态,NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pHpI pHpI pH pI,2019/5/4,48,电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。 蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。,2019/5/4,49,2019/5/4,50,双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。,2019/5/4,51,什么是固定化酶？,水溶性酶（细胞）,水不溶性载体,水不溶性酶或细胞 （固定化酶或细胞）,固定化技术,二、固定化酶及固定化细胞 固定化技术及应用,2019/5/4,52,酶在使用过程中 ： 1.稳定性差易变性失活 2. 只能在水溶液中催化底物反应 3.反应后与底物混在一起难回收 4.产物分离纯化困难,固定化酶： 1.保持酶稳定催化特性 2.长时间反复使用，利于连续自动化生产 3.利于产物分离纯化 缺点： 固定化过程中有时会引起酶的失活,2019/5/4,53,细胞的固定化方法,固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。是将完整细胞固定在载体上的技术: (1)它免去了破碎细胞提取酶等步骤，直接利用细胞内的酶， (2)固定后酶活基本没有损失。 (3)细胞生长快、而且多、反应快。 (4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。,2019/5/4,54,1.吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法,（二）固定化方法,吸附法 包埋法 结合法 交联法,分类,2019/5/4,55,常用吸附剂活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。 废水处理中的生物膜法是其代表性的例子。,固定化对于吸附载体的要求包括： 无生物毒抗物理降解、具有抗化学降解、抗生物降解的稳定性，具有一定的机械强度和结构稳定性。,2019/5/4,56,2、包埋法将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分子半透膜内的固定方法；前者又称为凝胶包埋法，后者则称为微囊法。,包埋法一般较少改变酶的高级结构，酶的回收率较高；但它仅适用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进入载体的网格。,1）凝胶包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶，大多数为球状或片状。 常用凝胶天然凝胶（琼脂凝胶、角叉菜胶、明胶等）和合成凝胶（聚丙烯酰胺凝胶等）,2019/5/4,57,图5-3 聚丙烯酰胺凝胶制成固定化细胞的结构,2019/5/4,58,2019/5/4,59,2019/5/4,60,2019/5/4,61,2）微囊法是利用各类型的膜将微生物细胞（酶）封闭起来，这类膜能使低分子产物和底物通过，而酶和其他高分子物质不能通过，所以只适合底物和产物都是小分子物质的酶的固定。,2019/5/4,62,3、结合法,1）离子键结合法 通过离子键使酶(或细胞)与载体结合的固定化方法。 载体不溶于水的离子交换剂:离子交换树脂 特点操作简单、条件温和、不会使酶失活；结合力弱、易脱落。使用时一定要严格控制好pH值、离子强度和温度。,2019/5/4,63,2）共价键结合选择适宜的载体，使之通过共价键与酶结合在一起的固定化方法。 载体纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物。,2019/5/4,64,4.交联固定化法（新型） 交联固定化法不使用载体，而是通过物理或者化学手段使细胞之间彼此附着相连，因此可分为物理交联法和化学交联法两种。 物理交联法： 利用细胞自絮凝形成颗粒（颗粒污泥）作为固定化的方法，此法在高浓度有机废水的处理方面正在发挥越来越大的作用。 活性污泥系统中菌胶团的形成及厌氧污泥场中颗粒污泥的产生均是通过细胞间自絮凝而实现的物理交联。,2019/5/4,65,化学交联法通过双功能或多功能试剂，在酶分子间形成共价键的连接方法。,（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶,2019/5/4,66,在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双重固定化法。,2019/5/4,67,(三)固定化酶的性质 酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。如微环境的化学组成，与酶相结合的表面结构，底物进入与底物排出微环境的速度，微环境的局部pH等。,2019/5/4,68,1. 稳定性： 固相酶的稳定性比游离酶高， （1）热稳定性： 固定化酶热稳定性较之天然酶提高。如氨基酸酰化酶,2019/5/4,69,(2) 对蛋白酶水解作用稳定性： 固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。,2019/5/4,70,(3) 对变性试剂作用的稳定性： 固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。,2019/5/4,71,(4) 保藏稳定性： 固相酶比天然酶保存的时间更长。 如：天然胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4保存4个月，残留活力仅为原活力的2%。偶联于琼脂糖后，在同样条件下，却可保存82%的活力，因此固相酶有利于运输、贮存和重复使用。,2019/5/4,72,2. 最适温度： (1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低。 例如：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高510； 以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高515。,2019/5/4,73,(2) 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。 如：氨基酰化酶 用DEAE葡聚糖凝胶经离子键结合法固定化后，其最适温度(72)比游离酶的最适温度(60)提高12； 用DEAE纤维素固定化，其最适温度(67)比游离酶提高7； 用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶则有所降低。,2019/5/4,74,3、最适pH： 酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适PH的因素主要有两个。 (1) 载体性质对最适pH影响： 用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH高。 用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。 用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。,2019/5/4,75,(2) 产物性质对最适pH影响； 若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适pH要高。 若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。 若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。,2019/5/4,76,4、底物特异性： 作用于小分子底物的酶类经固定化后，专一性基本不变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化后专一性会发生变化。 如： 胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3左右. 以羧甲基纤维素为载体经迭氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的5060。,2019/5/4,77,1酶制剂可用于化验诊断、治疗疾病。 从曲霉中提取的淀粉酶可用于治疗消化不良、溶菌酶可用于抗菌、消炎。,2酶制剂可用于加工生产一些产品。,三、酶工程的应用,2019/5/4,78,世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶,用来生产一种重要的甜味剂-果葡糖浆。此固定化酶在国内外均进行过广泛的研究和应用，1973年就已用于工业化生产。,葡萄糖异