《牛海绵状脑病》PPT课件.ppt

24牛海绵状脑病,(Bovine Spongiforn Encephalopathy, BSE),1、前言,牛海绵状脑病(Bovine Spongiforn Encephalopathy, BSE)俗称疯牛病, 它是一种类似脑病毒感染的传染病, 以潜伏期长,病情逐渐加重, 终归死亡为特征, 本病死亡率很高。首先发现的人类朊病毒疾病是库鲁病, 在动物中最早发现的是羊瘙痒病。 1985 年4月发现, 1986 年11 月将该病定名为BSE。,动物及人的各种朊病毒病:,由于此病迄今尚无法治疗, 又有传染给人之可能性, 使人得一种病死率极高的中枢神经退化病新型克雅病(New V arientCreutzfeldt-Jakob disease, NV -CJD ), 因此, 疯牛病不仅对经济造成严重损失, 而且引起了全球对疯牛病的恐慌。,2、病原学,朊病毒( Prion, 有人译为朊粒或朊蛋白) 是一种特殊传染因子, 它不同于一般病毒, 也不同于类病毒, 它没有核酸, 而是一种特殊的糖蛋白。用PrP 代表( Pr 代表Prion, P 代表Protein) 。,PrP,PrPc:是正常细胞具有的，对蛋白酶敏感，易被其消化降解， 存在于细胞表面，无感染性。,PrPsc:当结构异常时，就成为另一类有致病性PrP，对蛋白酶K有一定抵抗力。,prpc与prpsc的对比:,生物学特性: 朊病毒是一种有两种结构型, 一种是prpc, 正常情况下存在于细胞表面, 无感染性, 可被蛋白酶K消化降解, 可溶于去垢剂。当蛋白结构由螺旋变构成片层结构时, 具有了致病性, 称prpsc, 而不被蛋白酶分解, 不溶于去垢剂。,为什么会出现这种现象呢? 经过深入研究, 发现一种称为x 蛋白的物质参与了这种转变, 当prpc 与prpsc 的第96 167 位氨基酸结合, 同时prpscC 端残基再与x 蛋白结合, 这时促使prpc 变构成prpsc。,3、流行病学,BSE 患牛的比例:,最近, 美国和冰岛的科学家对BSE 蔓延又有新解释, 他们认为, BSE 的传播与生活在农场干草中的螨虫有关。,4、临床症状,BSE 和痒病在临诊上有许多相似的地方, 最大的区别是BSE 很少出现搔痒症状。神经症状可分为三个类型。,惊恐不安，有攻击性,恐惧不安，狂奔,5、病理变化,牛海绵状脑病无肉眼可见的病理变化, 也无生物学和血液学异常变化。典型的组织病理学和分子学变化都集中在中枢神经系统。牛海绵状脑病有三个典型的非炎性病理变化:,病理变化,( 1) 星型细胞肥大常伴随于空泡的形成,(2)牛海绵状脑病存在淀粉样病变, 但不 多见,(3) 出现双边对称的神经空泡,神经纤维网空泡,核浓缩,运动神经障碍,脑组织,分子病理学变化: 除了痒病家族应有特征性组织病理变化外, 牛脑组织提取液中还含有大量的异常纤维( SAF) , 可用电镜负染技术观察到, 这对牛感染牛海绵状脑病的确诊非常重要。,6、诊断,机体感染BSE后既无任何炎症, 也不产生免疫应答, 所以该病至今尚无血清学诊断方法, 病牛的血液生化指标也无显著异常。因此本病的诊断主要依据流行病学、临床症状和组织病理学进行初诊, 通过死后脑组织采样, 检测SAF以确诊BSE。,6.1 病理学方法,病理组织解剖及动物传递传染实验多用于发病后期及死后诊断，用任何新方法做出的阳性结果均需用此方法作以最终判定。,6. 1.1 组织病理学方法,是对BSE 感染的脑超薄切片进行电子显微镜观察，从而确诊BSE 疾病的一种方法。但这种检查一般是在疾病发展的后期进行，难以实现BSE 的活体检测。,6.1.2 动物试验,动物试验检测方法主要通过用怀疑感染患者的主要病变组织提取物注射到易感动物体内，通过观察易感动物的症状来诊断PrPsc。同种动物间的传播效率最高，而不同种动物间的传播具有种属屏障。,6.2 免疫学检测,6.2.1 Western blot Western blot是现在常用的蛋白质检测方法。主要原理是PrPsc在蛋白酶K 作用下产生PrP27230, 而PrPc 会被完全消化, 用antiPrP27230 抗血清与PrP27230 进行免疫反应即可检测出。由于样品需要蛋白酶K 预处理, 则不可避免地造成PrPsc 和少量PrPc 降解, 影响了该法的敏感性。,6.2.2 ELISA,此法是在western blot基础上建立的。进行检测时, 由于经蛋白酶K处理后, PrPsc 转变生成P rP27230, 后者吸附于塑料表面, 免疫反应性降低, 用硫氰酸胍变性后, 可使其表位充分暴露,免疫反应性增强。,6.2.3 免疫组化,免疫组化是利用标记的特异性抗体来显示组织切片上的PrPsc 。该法的主要原理是用单克隆抗体15B3 能区别PrPc和PrPsc, 并把PrPsc 沉淀而不沉淀PrPc, 可用于检测PrPsc。该法不但可以定性、定位研究P rPsc，还可以做到定量。,6.2.4 免疫印迹检测,以抗体T1对经蛋白酶K消化的脑组织提取物进行免疫反应，根据消化后的样品中是否含有抗蛋白酶K的PrPsc存在及其分子量的大小，就可以检测机体是否被BSE 所感染。,6.2.5 蛋白错误折叠循环扩增,该法由Saborio 等创立, 其主要是用类似于PCR 的原理体外扩增PrPsc的方法, 称之为蛋白错误折叠循环扩增(PMCA )。该法基于体外少量PrPsc能使大量PrPc构象发生转换, 生成PrPsc,形成PrPsc凝集物,用超声处理后生成许多小的 PrPsc 单位, 再以这些小的单,位为“模板”, 以PrPc 为“原料”继续合成PrPsc, 多次循环之后，扩增产物中97% 以上的蛋白具有蛋白酶抗性, 蛋白酶消化后,w estern blot 检测PrPc。该方法灵敏度高, 为PrPsc 的检测开辟了新的领域。,6.3 仪器检测法,6.3.1 毛细管电泳 Schimerr 等(1999) 首次报道了毛细管电泳可以检测TSE患者血液中PrPsc。其原理是将抗原抗体竞争试验与毛细管电泳结合起来。,6.3.2 光谱分析,目前光谱分析可分多光谱紫外荧光分析(MUFS) 和共聚焦双色荧光相关波谱分析(FCS)两种。光谱分析方法可直接检测PrP sc, 不需要蛋白酶K预处理。多光谱紫外荧光分析不需要借助于PK处理及特异性抗体就能直接检测。,共聚焦双色荧光相关波谱分析可检测溶液中荧光标记的单分子, 待检分子发射的荧光光子被激光识别后, 聚在一个点上, 在单光子检测上成像。,6.3.3 高效液相色谱,利用高效液相色谱检测与PrPsc 相关的疾病。该法主要是利用高效液相色谱检测prion 蛋白基因(PRNP)上某些与PrPsc相关的位点(如129位点) ,从而达到检测PrP sc的目的。,7、 各国检测BSE的新方法,7.1 奥地利 奥地利克普勒大学的科学家研制出用高灵敏度荧光显微镜和特殊抗体快速测定活牛BSE 的方法。朊病毒绝大部分集中在牛脑和脊髓里, 在牛血中其含量极其稀少。,克普勒大学研制出一种带有发光的染料分子抗体, 这种抗体加入血样后, 会附着在PrP 上。借助于高灵敏度的荧光显微镜, 就可以发现着色的PrP。,7.2 法国,法国用单克隆抗体检测人、牛、绵羊、鼠的PrP。与传统检验BSE的方法相比, 这种新的检测方法无需对牛进行宰杀,在感染早期只需取出其部分大脑样本即可, 也可用于死后检测。,7.3 德国,德国新发明了一种活体快速检测方法。这种检测法可以通过对活牛抽血化验, 迅速确诊牛是否已经被感染。这个方法与检查糖尿病用的血糖测试法相似。,先将BSE 抗体用发光剂标记，然后将其与被检牛的血样混合接着用一种“洗涤剂”清洗掉其中的干扰成分。经过发光剂处理的抗体会在血样中寻找朊病毒，一旦发现就会立即标识。,7.4 瑞士,有研究表明海绵状脑病的神经损伤可能是PrP与细胞内其他物质发生作用所致，血纤维蛋白溶酶原就是这类物质中的一种。瑞士苏黎世大学医院从人体和实验鼠的血清中分别提取血纤维蛋白溶酶原，将其涂在带磁性的微珠上，然后将感染羊痒病的实验鼠脑组织提取物与磁珠混合，发现血纤维蛋白溶酶原可与PrP 结合。,7.5 英国,鉴于朊病毒侵入大脑前首先在脾脏复制, 通过分析正常小鼠脾脏和感染BSE 小鼠脾脏的大约10000份RNA转录物, 发现在感染小鼠的脾脏中，红细胞分化相关因子(EDRF) 的转录水平下降。不仅如此,患BSE牛的骨髓中，EDRF 水平同样低于正常。但还不清楚朊病毒感染后EDRF减少的机理。据此原理，通过检测血液中EDRF 水平来诊断BSE ， 在小鼠和羊试验成功。,7.6 美国和以色列,美国对vCJD、BSE 和其他传染性海绵状脑病的尿液检验方法, 这种方法可准确诊断BSE。一种独特的、高度敏感的检测技术构象依赖的免疫测定(CDI) , CDI 能有效地发现正常个体和捐献的血浆中少量的朊病毒。,7.7 我国BSE检测现状,我国在吸取了国外先进技术的同时，检测疯牛病的方法也正日臻完善。目前，我国共有3 个国家级的BSE检测实验室，即农业部动物检疫所(青岛) 、北京出入境检验检疫局和中国农业大学的BSE检测实验室。北京出入境检验检疫局技术中心BSE 检测实验室主要采用病理学方法、免疫组化法和免疫转印法。,动物检疫所全国疯牛病检测中心从瑞士引进了免疫转印、免疫组化和酶联免疫吸附测定等PrP免疫检测技术,目前主要采用免疫组化法,因为它的检测成本比较低廉, 特别是试剂。,8、防制,由于目前该病没有有效治疗方法，主要以预防为主，为了控制本病，各国纷纷采取措施， 禁止从发生BSE的国家进口牛、牛制品及反刍动物性饲料，切断BSE 的传播途径。我国为防止疯牛病传入, 也采取了一系列行之有效的措施, 早在1990 年6 月农业部就印发了关于严防牛海绵状脑病传入我国的通知，决定停止从英国进口牛、牛精,液、牛胚胎、牛肉、牛骨粉等，并禁止从有牛海绵状脑病的国家进口牛及其产品。1992 年6 月，该病增列为中华人民共和国进境动物一、二