《生物农药》PPT课件.ppt

生物农药,一：绪论 二：植物源农药 三：微生物源农药 四：杂草的微生物防治 五：动物源农药,报告主要内容,绪 论,生物农药的提出 生物农药的定义 生物农药的分类 生物农药与化学农药的比较,发展生物农药的必要性,合国粮农组织(FAO)：全世界每年因病虫害造成的损失约占粮食总产量的1/4，除了造成农产品减产外，还直接造成农产品品质下降。 我农作物病虫害常年发生面积大约有3.6亿hm2，每年损失粮食约1600万t，每年需使用农药近百万吨，化学农药制剂防治病虫害，导致了20%以上的果蔬和10%以上的粮食农药含量超标，给人们的健康和生态环境带来了巨大的安全隐患。 生物农药具有对人、畜及生态环境影响小，对农产品无污染，对靶标害虫针对性强，有利于保护害虫天敌以及害虫不易产生抗性等优点，是防治害虫最有效途径之一，也是绿色农业的理想选择。,生物农药的定义 起源于生物并用为农药的物质或生物活体都视为农药，所以有人将生物农药也称为生物源农药,生物农药分类,生物农药包括抗细菌、真菌、病毒、植物、昆虫天敌、农用抗生素、植物生长调节剂和抗病虫草害的转基因植物等。,与传统化学农药比较,特点之一安全可靠 生物农药可减少农药对环境的污染，确保人畜安全，不易使害虫产生抗药性，对生态有保护作用。,特点之二经济效益明显 虽然生物农药的生产成本稍高于化学农药，但生物农药可以广泛用于绿色食品和有机食品的生产，提高农作物的品质，因而产生更大的经济效益。如现在绿色蔬菜或有机蔬菜等的市场价格要比使用化学农药的高10倍之多，如有机草莓出口欧盟价格是6元/kg，而使用常规化学农药的草莓价格仅为06元/kg,特点之三开发效率高 由于化学新药筛选成功率愈来愈低，对新药性能的要求愈来愈高，因此新药筛选越来越困难。筛选化学农药的机率只有1/20000，而生物农药的成功率是1/5000。化学农药的开发周期、开发费用和注册费分别是生物农药的3倍、40倍和100倍。这种状况迫使农药企业寻求新的发展途径，有更多的投入来开发生物农药。生物农药产业化现状,生物农药主要不足点,见效慢，它难以对付爆发性、毁灭性的病虫害。 在环保问题上的优势也是相对而言的。比如说污染小，但并不是没有污染。例如齐墩霉素的毒性也是比较高的。 一种药只能治一种害虫，不能混合使用，如果田里有几种害虫，那就得把几种药分别喷洒几遍。 稳定性差。,第一节 植物源农药,植物源农药定义 植物源农药来源 植物源农药的有效成分 举例植物源农药杀虫机理,植物源农药定义,把杀虫植物中能产生杀虫物质的根、茎、花、果实、种子等进行提炼加工而制成的杀虫制剂称为植物源杀虫剂。,植物源抗菌、杀菌农药资源,地球上有着丰富的杀虫植物资源， 有些植物体内含有的某些成分如烟碱、苦参碱、印楝素、川楝素、茼篙素、异羊角扭甙、茶皂素、鱼藤酮、除虫菊酯、植物精油和转基因植物( 种子) 等，这些都可以可以用来杀虫， 我们把这些植物称之为杀虫植物。,植物源杀虫剂的活性成分， 按其化学结构主要分为以下几大类： 苯酚类和醌类 生物碱类 萜烯类 菑族类 香豆素类 木聚糖类 多炔类等,植物源杀虫剂的作用机理分类,影响昆虫激素代谢，干扰生活史周期的进程， 如印楝素具有抗昆虫蜕皮激素的作用，进而干扰其蜕皮，导致昆虫产生形态上的缺陷。 破坏昆虫消化系统，造成虫体死亡，如苦参碱、金雀花碱对昆虫具有胃毒麻痹作用，致使昆虫不进食或饱食而致死。 抑制昆虫呼吸，导致虫体窒息而死，如奈醌类物质作用于线粒体复合体，抑制呼吸作用。,杀虫剂有效成分与乙酰胆碱受体结合，干扰神经系统的正常功能，如川楝素可对昆虫下颚瘤状栓锥感受器产生抑制作用，而这种抑制作用使神经系统内取食刺激信息传递中断，幼虫失去味觉功能而表现为拒食作用。 能与离子通道载体蛋白结合， 阻止或促进离子的转运， 如胡椒素、西藜芦生物碱、墙草碱都能与细胞膜上的钠离子通道蛋白结合， 延长通道开放时间， 引起虫体休克死亡。,植物源农药印楝,印楝(Azadirachta indica A. Juss.)是楝科楝属乔木，原产于印度次大陆，具有杀虫、杀菌和杀线虫等多种生物活性。1968年联合国在一份报告中称印楝是“本世纪对当地居民的最大恩赐”，印楝被美国农业部誉为“可解决全球问题的树”。印楝杀虫剂是当今世界公认的最优秀的生物农药之一，其国际影响与市场空间日益扩大。从印楝中发现了以印楝素(aza-dirachtin)为主的80余种杀虫活性物质，对10余目400多种农、林、储粮和卫生害虫有生物活性。,印楝活性物质及除害机理,对印楝种子种仁和叶片的提取物进行化学分析，发现在提取物中至少有9种化学活性物质能够影响昆虫的活动。而其中Azadirachtin，Salannin，Meliantriol和Nimbin 4种成份起主要作用。从化学结构上看，这4种印楝活性成份主要为三萜类物质，与类固醇、甾类等激素类物质结构相似。 当害虫吸收了这些活性成份后，自身体内激素平衡被破坏，内分泌系统运转失常，新陈代谢，生长发育失调，大脑和身体各部分功能紊乱，生殖功能丧失，不能繁衍后代，最终使昆虫群体数量下降。,它们的化学结构式如下:,salannin,meliantriol,印楝素杀虫机理之一导致厌食,某些有害幼虫的口器上有对印楝素敏感的感觉器，其拒食原理为印楝素不但激活了昆虫下颚栓锥感器的厌食神经原，而且还抑制了引起食欲的神经原的信号发放。 印楝素（蜕皮甾酮）通过cAMP-蛋白激酶系统介导，对动物产生作用，包括影响糖代谢，影响脂类代谢等。,用印楝素处理4龄幼虫，其体重逐渐下降，处理后第25天测定，其平均体重则约为对照的一半。,印楝素杀虫机理之一导致厌食,同时对幼虫腹部背面脂肪体用扫描电子显微镜作了观察，发现处理幼虫的脂肪体表面颗粒粗大，表现为融烛状。处理幼虫的胸部皮下脂肪全部消失。此外，在解剖中也发现，处理幼虫的食道干瘪，没有食物存在。这些表现可说明处理幼虫在延长的幼虫期间并不取食，处于饥饿状态，只靠消耗体内的水分和营养，特别是脂肪来维持其生命，一旦这些物质耗尽，幼虫便干缩而死。,印楝素杀虫机理之一导致厌食,印楝素杀虫机理之二抑制繁殖,在卵子发生末期，处理雌虫的卵巢蜕皮激素浓度比对照大大下降，这是神经内分泌系统受干扰的结果。因此，印楝素作用于神经内分泌系统、干扰了保幼激素、蜕皮激素和卵黄原蛋白的产生，从而减少了卵的生成量。 这主要是印楝素阻止了保幼激素的产生，从而阻止了脂肪体内卵黄原蛋白的合成和卵的生成，也有可能是通过激素控制，干扰了卵黄原蛋白的结果。,印楝素杀虫机理之二抑制繁殖,保幼激素昆虫在发育过程中由咽侧体所分泌的一种激索。在幼虫期，能抑制成虫特征的出现，使幼虫蜕皮后仍保持幼虫状态；在成虫期，有控制性的发育、产生性引诱、促进卵子成熟等作用。 蜕皮激素是由昆虫的前胸腺所分泌的一种甾体激素，严格调控昆虫的蜕皮、变态和繁殖。,用印棣素处理过的幼虫的生殖器官也表现有病理变化。解剖处理后25天左右的幼虫，可看到雌虫的卵巢显著肿胀，组织松散，其卵巢小管，则比对照幼虫的长而粗，输卵管也较粗;雄虫的睾丸也比对照的肿大，且组织松散，解剖时很易破碎，输精管也较粗。,印楝素杀虫机理之二抑制繁殖,印楝素杀虫机理之二抑制繁殖,亚洲玉米螟幼虫生殖器官 a.b.c为3、4、5龄正常幼虫的卵巢;d.用印楝素处理后25天幼虫的卵巢; e.f.g为3、4、5龄正常幼虫的睾丸;h用印楝素处理后25天幼虫的睾丸,综上机理之二所述印楝素一方面通过影响卵子的产生及其正常功能，另一方面通过破坏昆虫的生殖器官来影响昆虫的繁殖。,印楝活性成份Azadirachtin的结构与昆虫的“蜕皮激素”结构相似，当昆虫吸收了这种成份后，前胸腺细胞遭到破坏，自身蜕皮激素的分泌被抑制，其它激素的产生和释放被阻止，使害虫幼虫不能正常蜕皮和羽化，生命周期被破坏，导致害虫死亡。,印楝素杀虫机理之三形态变异,a蜕皮酮主要是由要是由前胸腺分泌的，经酶的作用后转化成有活性的蜕皮酮而发动昆虫的蜕皮周期。用印楝素处理幼虫长期不化蛹，其体内蜕皮激素的含量发生了变化，经透射电子显微镜观察，发现处理幼虫的前胸腺细胞膜比较厚而松散，并常和膜内细胞器分离。,在处理后发育延缓的幼虫中，常有部分幼虫不蜕皮长大，所以头壳较小亚洲玉米螟34龄幼虫经印棣素处理约1215天后，前胸腺的外部形态逐渐发生变化，细胞变得肿胀而又肥大。延续的幼虫期越长，这种现象越明显。通过测量，发现处理幼虫前胸腺的细胞个体显著大于对照幼虫的，但二者的细胞个数无明显差异，处理幼虫前胸腺的细胞个体一般为正常5龄幼虫的2倍但也有少数的可大8倍。,印楝素杀虫机理之三形态变异,印楝素杀虫机理之三形态变异,印楝素杀虫机理之三形态变异,综上杀虫机理之三所述印楝素杀虫主要是依靠破坏前胸腺细胞，使之不能产生蜕皮激素来破坏其正常生理过程。,关于印楝素提取工艺之一,欧洲专利报道了极性溶剂和非极性溶剂协同萃取的工艺，流程为：种子去皮粉碎加入正已烷和乙醇同时萃取印楝油和印楝素活性成分过滤萃取液浓缩浓缩物以正已烷处理浓缩物过滤干燥得含印楝素的产品。,第二节 微生物源农药,微生物源农药定义 微生物源农药分类及来源 微生物源农药杀虫机理,微生物农药定义,微生物农药是指应用微生物活体及其代谢产物制成的防治作物病害、虫害、杂草的制剂，也包括保护生物活体的助剂、保护剂和增效剂，以及模拟某些杀虫毒素和抗生素的人工合成制剂。,微生物源农药分类,微生物杀虫剂：细菌杀虫剂、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、微孢子杀虫剂、线虫杀虫剂 微生物杀菌剂：微生物杀菌剂是一类控制植物病原菌的制剂，主要有农用抗生素、细菌杀菌剂、真菌杀菌剂和病毒杀菌剂等类型 微生物除草剂：活体微生物除草剂、农用抗生素除草剂,苏云金芽孢杆菌杀虫剂是目前世界上用途最广、产量最大、应用最成功的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的95%以上，已有60多个国家登记了120多个品种，广泛应用于防治农业、林业和贮藏的害虫。 苏云金芽孢杆菌杀虫剂 H-抗原：83个亚种，70个血清型； 已分离到200多个杀虫基因：B. thuringiensis subsp. kurstaki大多含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac杀虫晶体蛋白基因， Cry1Ac基因毒力最强，对鳞翅目昆虫具有特异的杀虫活性；,B. thuringiensis subsp. aizawai Cry1C基因对灰翅目夜蛾毒力较强； B. thuringiensis subsp. tenebriouts Cry3A基因对鞘翅目昆虫有毒性； B. thuringiensis subsp. israelensis Cry4A Cry4B，Cry11A，Cyt1A基因对蚊虫有毒性；,苏云金芽抱杆菌的作用机制,苏云金芽孢杆菌的作用机制：芽孢及毒素。毒素按存在的部位可分为能分泌到细胞外的外毒素和存在于细胞内的晶体毒素。 -外毒素：即磷脂酶C，具有破坏昆虫肠道，对热、胰蛋白酶敏感。pH10或3.5丧失杀虫活性； -外毒素：苏云金素，为腺嘌呤核苷酸衍生物，热稳定，是RNA聚合酶的竞争抑制剂可干扰有关激素的合成； -外毒素：使卵黄变澄清的一种蛋白质，对昆虫毒力未定；,-内毒素：即伴孢晶体(parasporalcrystal)毒素，对不同昆虫有特异毒性，被昆虫吞食后，在昆虫中肠特殊pH条件下被溶解释放出杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs）。然后，在中肠拟胰蛋白酶的作用下，通过剪切被激活。激活的ICPs特异地与中肠上皮细胞受体结合，从而使细胞通透性破坏，最后导致膜穿孔，使整个细胞代谢失去平衡而导致昆虫死亡。,（一）杀虫晶体蛋白引起细胞裂解的机制,在细胞水平上解释ICPs使细胞裂解的机制有两个模型： 质子梯度模型 ICPs在柱状细胞冠膜诱导形成一个选择通道，从而导致H+的流出，使冠膜分离小室拥有高1 000倍的H+浓度梯度遭到破坏，导致昆虫死亡。 此模型可解释对鳞翅目和具有高pH中肠的昆虫的致死现象,渗透裂解模型 Haide等在研究ICPs对细胞的作用时发现，当加入渗透保护剂时，可以保护细胞不被ICPs诱导裂解。于是，认为苏云金芽抱杆菌ICPs杀死细胞是通过一个渗透裂解的过程； 昆虫中肠被苏云金芽抱杆菌ICPs破坏的组织病理学研究表明，细胞裂解经过一个细胞起泡，膨胀和出芽的过程。当细胞被ICPs诱导破坏时可形成直径0.5-1.0 nm的孔，这个孔的大小不能使细胞质的大分子渗漏，但可使离子平衡遭到破坏，使细胞渗透裂解。,在上述研究基础上， Knowles等人提出了解释ICPs作用于昆虫中肠细胞的模型。认为在柱状细胞冠膜外选择性孔的形成引起离子的渗漏，但柱状细胞的大分子不能通过0.6 nm的孔流出，小的离子能进出细胞，通过渗透作用吸收水份，从而使细胞膨胀裂解。,而杯状细胞的K+则主要靠柱状细胞所提供，由于细胞间运输K+的通道被关闭，也就降低了杯状细胞K+和H+的交换活性，使得H+不能交换出去，这就不可避免地引起ATPase酸化杯状细胞腔导致ATPase失活，最终使整个细胞崩溃。这个模型可解释组织学所观察到的细胞病变，适合于解释苏云金芽抱杆菌ICPs对所有昆虫细胞的作用过程。,为了在分子水平上解释膜穿孔的机制，人们利用蛋白质及脂膜相互作用的生物化学原理，通过结构比较和功能分析提出了如下模型。,（二）杀虫晶体蛋白引起膜穿孔的分子机制,（1）“铅笔刀”模型,Hodgman等比较了来自不同类型ICPs的氨基酸序列，没有找到适合于跨膜的-桶式结构能用于膜孔的形成； 但发现不同ICPs在氨基酸序列上尽管有差异，能够形成亲水脂结构的6个-螺旋却明显是保守的。基于不同毒性肽的序列比较和结构推测，6个-螺旋可形成一个六聚体的离子通道，其中心孔为0. 6 nm。依此，他们提出了一个铅笔刀模型。,该模型基于亲水脂螺旋的疏水表面积推测，-5螺旋和-6螺旋最可能是孔形成的结构单位。 其它ICPs序列与Cry3A杀虫晶体蛋白的结构的比较表明，这两个螺旋在所有不同ICPs中是高度保守的。-5螺旋和-6螺旋连在结构域的端点，离膜最远。在作用于膜时，这两个螺旋必须象打开的铅笔刀一样从结构域中伸出，插入脂双层膜。一个亲水离子通道将由多个毒素分子寡聚体通过相同的作用方式排成一个圆而形成。,“铅笔刀”模型示意图,Li等利用2. 5埃的分辨率对Cry3A的晶体结构进行了分析，提出了杀虫晶体蛋白的二维空间结构，使得孔形成的机制研究有了新的突破。根据Cry3A的空间结构，可分为二个结构域，这二个结构域包括了整个活性片段的五个保守区。在结构域里，从N端的1290个氨基酸残基组成了7个a螺旋，其中a-4、a-5螺旋被其它5个a螺旋相对倾斜20角包围形成一个螺旋束，这个结构被认为是孔形成的特有“装置”。因此，Li等人根据ICPs可能所共有的二维空间结构提出了“伞模型”。,（2）“伞”模型,依照这个模型，a-6和a-7螺旋或a-4和a-5螺旋形成一个发夹结构，最接近于质膜。螺旋在膜表而象伞架打开时，这一对螺旋将比较容易插入脂双层膜。整个孔的形成需要多个毒素分子内部不同结构域或螺旋的参与。,“伞”模型示意图,Gazit等分析了a-5螺旋片段(即Cry3A的193 215氨基酸残基)，发现该片段在所有ICPs中都是高度保守的，认为a-5螺旋在参与膜穿孔作用起着重要作用，可能是螺旋束跨膜形成孔的重要成分。 a-5螺旋在序列和结构上和一些抗微生物多肽都具有很大的相似性。通过其它毒素插入膜结构和跨膜离子通道的比较研究，苏云金芽孢杆菌ICPs能形成孔的结构至少有20个氨基酸残基所组成的亲水脂螺旋才有足够的长度横跨膜双层，而a-5螺旋具备这一长度。,（3） a -5螺旋六聚体模型,实验表明，a-5螺旋能够作为跨膜片段象其它蛋白质一样形成离子通道，a-5螺旋可通过一个6聚体亲水离子通道，a-5螺旋的亲水侧向内，亲脂侧向外，镶嵌在脂双层中间。,（三）杀虫晶体蛋白分子亚结构的作用,鉴于上述模型局限在ICPs二维结构中结构域的作用，还不能更精确的解释ICPs分子的作用机制。近两年来，人们着重通过定点诱变技术对ICPs分子不同结构域的亚结构进行了研究，获得了一些新的信息,Chen等将Cry1Ab结构域的a-4螺旋和a-5螺旋之间凸环处的Y 153诱变为R和D，发现在结构稳定性、受体的亲和力(Kd)和结合浓度(Bmax)与野生型相比都没差异。但Y 153突变体的膜插入要比野生型和其它突变体要弱，可能是在这个位置换成带电荷氨基酸后，在结构上不利于插入脂膜的缘故。 目前对ICPs的作用机制已有所了解，但仍缺乏更精确的信息。苏云金芽孢杆菌ICPs结构与功能分子作用机制研究，为进一步在分子水平上利用基因操作及蛋白质工程技术开发这微生物杀虫剂奠定基础。,（1）结构域的诱变,（四）苏云金芽孢杆菌菌剂一种生产流线图,沙土管菌种,茄形瓶活化,种子罐培养,发酵罐培养,浓缩,干燥,质量检验,苏云金芽孢杆菌菌剂生产工艺流程,30培养72h,接种量1%,（五）影响苏云金芽孢杆菌致病力的主要因素,日光直射的影响：紫外照射10min99.9%失活；阳光下30min50%失活，60min80%失活 温度的影响：最适温度为2432；较适温度为1824或高于32 ；不适温度为1317；低于13 ，效果极差 湿度和降水的影响：雨水冲刷影响其残效期，田间湿度则通过影响雾滴的蒸发作用而影响其防治效果,第三节 杂草的微生物防治,一 杂草微生物防治的概念、方法及防治机理 二 有除草潜能的微生物类型 三 国内外微生物除草剂的研究概况 四 微生物除草剂开发的限制因素和对策,一 杂草微生物防治的概念、方法及防治机理,（一）杂草微生物防治的概念 杂草微生物防治是谨慎地利用专一性致病微生物（细菌、真菌、病毒等），将影响人类经济活动的杂草种群控制在经济上、生态上或美化环境上可以允许的水平内。,（二）杂草微生物防治的方法,一般可分为两种方法： 经典的或传统的方法从外地引进能持久建立种群的专一性病原微生物来控制杂草的方法 微生物除草剂的方法将工厂化生产的病原微生物制剂大面积喷洒来防除杂草,（三）微生物除草剂的除草原理,利用微生物所产生的次生代谢产物植物毒素 微生物的代谢产物中有使植物感病，产生病斑或枯萎的活性物质成分，而这种活性物质成分侵入寄主植物，使其感病，破坏其细胞结构，以达到杂草防治的目的。 生物除草剂的杀草机理涉及到防除对象的侵染能力、侵染速度及对杂草的损害性等。 对于不同的生物除草剂其杀草机理不尽相同。,二 有除草潜能的微生物类型,（一） 真菌 目前报道的有除草潜能的真菌主要有9个属，分别是：刺盘孢菌属、疫霉属、镰刀菌属、交链孢霉属、柄锈霉属、尾孢霉属、叶黑粉菌属、壳单孢菌属和核盘菌属。 真菌是微生物除草剂研究最多的，其中刺盘孢菌属报道的情况最多。,（二）细菌,具有除草潜能的细菌主要是根际细菌，有7个属：假单孢菌属、肠杆菌属、黄杆菌属、柠檬酸细菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、黄单胞细菌。 黄单胞菌属既是重要的植物病原菌，也是工业上应用较多的一类细菌。 在加拿大，从草原土壤中已分离出1000株以上的细菌作为防除一年生杂草的目标菌株。,三 国内外微生物除草剂的研究概况,1981年De Vine在美国被登记注册为第一个生