2015年基因工程实验手册.doc

本科实验教学基因工程实验指导贵州大学农业生物工程研究院2015年4月实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定一、实验原理：实验所用载体为Promega公司T载体pGEM-T Easy Vector，特点为在载体中存在两个T末端。使用LA Taq进行扩增得到的大部分PCR产物3端附有一个“A”碱基。T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3，5磷酸二酯键。PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2法），其原理是培养至对数生长期的细菌在0经过低渗CaCl2溶液致敏处理，就可以成为高效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置于030min，混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，再经42短时热激处理，促使质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补，抗生素基因等（本实验中使用的T载体pGEM-T Easy Vector本身具有Amp抗性）。现在使用的许多载体都有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，-半乳糖苷酶基因在缺失近操纵区段的宿主细胞与带有完整近操纵区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由于-互补而产生的-半乳糖苷酶基因和细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时，可产色蓝色菌落，易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，宿主细胞与质粒之间不能形成-互补，从而使带有重组质粒的细菌形成白色菌落。对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体。用含有一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液）悬浮菌体，采用碱性SDS（十二烷基硫酸钠）溶液裂解菌体的细胞壁，使质粒缓慢释放出来，同时整个液体的pH为12-12.5，双链DNA变成单链，当pH调至中性并有高盐浓度存在下，绝大多数变形质粒恢复自然状态溶在液体中，而变形染色体不能复性，断裂呈线性的单链细菌染色体DNA 相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质形成沉淀，离心获得含有大量质粒的上清液，再利用适当浓度的亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇）使质粒DNA脱水，离心等到质粒沉淀。限制性内切酶能识别并切割特异位点的DNA序列。其被广泛应用于载体构建。提取的质粒DNA，利用限制性内切酶EcoR I（GAATTC）进行酶切，可将目的基因切下。酶切结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。二、实验材料PCR胶回收产物，pGEM-T Easy Vector（Promega），已制备的大肠杆菌DH5感受态细胞三、实验仪器PCR仪、制冰机、水浴锅、37摇床、离心机、涡旋振荡器、电泳槽四、实验试剂1. Solution（0-4保存）:50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L TrisCl(pH8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0) 2. Solution(现配现用):0.2mol/LNaOH；1% SDS3. Solution（0-4保存）:0.2mol/L KAC 60mL；冰乙酸 11.5ml；ddH2O 28.5ml(pH4.8)4. Rnase: 100mg Rnase粉剂，溶于10ml 10mmol/L TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl缓冲液中，水浴煮沸15min,冷却，20保存。五、实验步骤1.PCR产物的连接于冰水浴中配制如下反应体系。总体积10.0LT4 DNA 10lig Buffer1.0LpGEM-T Easy Vector1.0LPCR产物3.0LT4 DNA连接酶1.0LddH2O 4.0L 用移液枪吹打连接反应使之混匀后，4孵育过夜。2.连接产物转化大肠杆菌（1）将-80保存的DH5感受态细胞置于冰中溶解10min。（2）取100L感受态细胞至新的1.5mL离心管中。（3）向感受态细胞中加入0.1ng-10ng（约7ul）转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30min。（3）42水浴锅中放置45s后，立即冰中放置2min。（4）加入890L 37预温的LB培养基。（5）37,200rpm振荡培养1h，4000g，室温离心1min。（6）倒掉上清，向沉淀中加入100LLB液体培养基后充分混匀，取30L悬浮菌液涂布于LB抗性平板（2% X-Gal：40L；24mg/mL IPTG：7L；100mg/mL Amp：30L）。（5）37下倒置培养12-16h，挑选白色单菌落扩增培养。3.质粒DNA的提取（1）将含有目的基因的阳性克隆菌落从LB抗性平板上接种到5mL含有Amp的LB液体培养基中，37,200rpm，过夜摇菌。（2）取1.5-5.0mL菌液至1.5mL离心管中，10,000g，4，离心1min，倒掉上清液。重复操作一次。（3）向沉淀中加入150L的Solution，涡旋震荡，直至没有沉淀。（4）加入200L Solution，轻柔的上下翻转离心管数次，使之混匀，冰中放置3min（加入Solution后在冰上放置不要超过5min）。（5）加入150L Solution后立刻混匀，冰中放置3min。（6）10,000rpm，4，离心10min，将上清液转移到另一离心管中。（7）加入2倍体积的无水乙醇（约700L），颠倒离心管数次以混合，-20放置20min。（8）10,000rpm，4，离心10min，弃上清液。（9）加入1mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。（10）去掉上清液，倒扣于吸水纸上几分钟，在空气中使沉淀干燥或真空抽干，干燥的标志为白色沉淀变为半透明或透明。（11）加入18L ddH2O溶解沉淀，加2L RNase（100mg/mL），使RNA酶终浓度为20mg/mg，振荡，37度保温40分钟。（12）-20保存备用。4.质粒DNA的酶切（1）于冰水浴中配置如下反应体系。ddH2O7.9L10H Buffer1.0L质粒0.6LEcoR I0.5L总体积10.0L（2）用移液枪吹打反应体系使之混匀后，37反应30min。（3）电泳检测六、实验结果分析： 本实验中连接形成的重组质粒具有Amp抗性，转化细胞可在相应培养基中形成菌落，在IPTG和X-Gal作用下形成蓝白斑。转化大肠杆菌铺板后12-16h观察抗性菌落及蓝白斑。附照片。 提取的质粒，利用限制性内切酶EcoR I进行酶切，可将目的基因切下。酶切情况通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，照相。七、注意事项：1. 实验中所有酶均需于冰上操作。2. 严格按照规定使用酶的用量3. 电泳时注意自身防护，切勿手触试剂4. 大肠杆菌感受态一定放冰上进行实验操作。5. 热激和冰浴时间要准确。实验二 农杆菌介导的烟草遗传转化一、实验原理 根癌农杆菌携带的Ti质粒TDNA区片断能在诱导物的作用下进入植物细胞并整合到植物核基因组中。由于植物细胞的全能性，在无性繁殖的过程中，携带外源基因片断（T-DNA片断）的植物细胞经诱导培养再生后得到完整的转基因植株。二、实验材料 植物材料烟 草Nicotiana tabacum cv.K326 农杆菌根癌农杆菌EHA105培养基共培培养基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA +3%sucrose+0.7% agar pH5.80筛选培养基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+ 3% sucrose + 0.7% agar+ 100mg/L Temetin+100mg/L Km pH5.80生根培养基：MS + sucrose 2%+0.75% agar+100mg/L Temetin+100mg/L KmYEP培养基：10g/L peptone，10g/L Yeast Extract及5g/L NaCl。 pH:7.20重 悬 液: MS pH5.80实验仪器：超净工作台 摇床 离心机三、实验步骤烟草叶片材料的准备烟草叶片经75%酒精消毒30s，0.1%升汞消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次后， 取消毒后的烟草叶片，切去叶片边缘,再将叶片切成约0.5cm*0.5cm见方的叶盘。农杆菌的培养及活化1.用接种针蘸取-80冻存的农杆菌在YEP（20mg/L rif，50mg/L km，1.5% agar）固体培养基上活化，28恒温培养24小时左右，直到长出合适大小的菌斑。2.用牙签挑取农杆菌单菌落放入5ml YEP（20mg/L rif，50mg/L km）培养基中，200rpm 28震荡培养24小时左右。3.于5ml菌液中取500-1000ul加入到50ml YEP培养基中，200rpm 28振荡培养，至OD600值达到0.4-0.7。将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4离心10 min，收集菌体。遗传转化1.用MS重悬液重悬农杆菌菌液，调节OD600为0.30.4。2.将烟草叶片放入重悬菌液中，浸泡6min。3.将侵染过的烟草叶片，用滤纸蘸干，紧密排列于共培养基中；25-26黑暗条件下共培养三天。4.将共培养3天的烟草叶片，转接于筛选培养基中。5.10d继代一次，4周后即有愈伤组织的形成和芽的分化。6.待筛选后的绿芽长到2cm高左右时，切下绿芽转入生根培养基。 7.待抗性苗长至8-10cm时，炼苗移栽至花盆中，继续培养，直至收获种子。四、实验结果分析：1.烟草叶片在筛选培养基上培养4 d后，观察材料的污染情况；2烟草叶片在筛选培养基上培养21 d后，观察材料的愈伤诱导及芽诱导情况，并统计出芽率。出芽率=诱导出芽外植体数/接种外植体数；（留出位置附照片）五、注意事项：1. 留出一部分叶盘做对照，暗处共培养3d。2. 叶盘要放平，使其边缘与培养基充分接触，保证未转化的细胞处于选择压力下。3. 爱护实验室仪器以及药品，实验时不要大声喧哗，保持安静。4. 酒精灯、锋利刀片要正确使用，注意安全。实验三 转基因植物表型观察、GUS（-葡萄糖醛酸糖苷酶）表达活性分析及鉴定一、实验原理BAS1基因是调控油菜素内酯分解代谢的基因，该基因能使油菜素内酯活性降低，从而影响转基因植株的生长发育。 GUS基因是转基因植物使用较多的一种报告基因，具有检测快速简洁高效的特点。GUS组织化学法染色原理为：适宜的反应条件下（一般37），取实验材料、加入GUS酶的将底物X-Gluc（5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），在酶的活性部位产生沉淀，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在95高温时变性会变成单链，低温（一般是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。利用BAS1基因的引物扩增植株基因组DNA，从而鉴定是否为转基因植株。二、实验材料1. 植物材料 转BAS1基因烟草叶片（实验室提供）2. 试剂（1） 10Buffer (10ml ) 1M Tris (pH7.5) 10mlNacl 290mgK3Fe(CN)6 66mg（2） 染液 (10ml) 10Buffer 1mlMethanol(甲醇) 2mlX-Gluc 5mgWater 7ml三、 实验仪器注射器、37恒温箱等四、实验步骤1.表型观察观察转基因烟草与非转基因烟草形态等差异变化。2.GUS染色（1）取转BAS1基因烟草叶片徒手切成细丝后放入置于PCR管中，用注射器反复抽真空5-6次；（2）加入GUS染液10l，置37恒温培养箱放置0.5-3h或者放置过夜反应； （3）吸取染液，依次分别加入各1mL 20、50、70、100乙醇脱色，每次脱色0.5-1 h，直至叶绿素消失，拍照观察。3.PCR鉴定基因组DNA提取CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide）A、试剂2CTAB提取缓冲液：2g/100ml CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100 mmol/L TrisCl（pH8.0）PVP（聚乙烯吡咯烷酮）B、操作（1）2 mL离心管中加入0.5 mL CTAB提取缓冲液，65预热。（2）取0.1-0.2g新鲜幼嫩叶片，去除叶脉，置于研磨中，加入液氮（研磨过程中加入0.01g PVP及少许石英砂）迅速研磨成粉；（3）将冻粉迅速转入盛有提取缓冲液中，涡漩振荡器上1 min，于65水浴保温30 -60min。其间晃动23次。（4）取出离心管，冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻缓颠倒混匀2-3次，室温放置10 min。（5）10000 r/min离心10 min。转移上清液于另一离心管中，加入2/3倍体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15 min。（6）10000 r/min室温离心10 min，