蛋白质的分离与纯化重组蛋白质表达分离与纯化技术讲座.ppt

重组蛋白质表达分离与纯化技术讲座,赢润生物,,蛋白质(Proteins),蛋白质是一切生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成。,,氨基酸,人类一共有20种常见的氨基酸，它们的排列组合形成了人类绝大多数的蛋白质。,,氨基酸链组成的蛋白质,蛋白质是由氨基酸分子呈线性排列所形成，相邻氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起。,,我们为什么要纯蛋白质,生命科学研究：蛋白质的结构功能，以及其在生理以及病理学的意义； 工业或者治疗：比如血液制品人血白蛋白，以及从猪胰脏中获得的胰岛素制剂； 用于药学研究等，比如能够使一些细菌产生的抗性的蛋白；,,生物体如何合成蛋白质,我们知道蛋白质虽然结构变化多端，但其实由20种氨基酸以特定的序列组成。但这个序列又从何来？ 近代分子生物学发现，绝大多数蛋白质序列都是脱氧核糖酸DNA编码的，但无论是人类，高等动物，高等植物还是细菌。即称为中心法则(Genetic Central Dogma),生物体的中心法则,中心法则(Genetic Central Dogma)： 是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译的过程，以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程。,,Central Dogma of Molecular Biology,Proposed by Francis Crick, 1958,,细胞内的蛋白质合成,,如何获得蛋白质？,天然蛋白,从动植物组织中得到天然状态的蛋白,有机化学合成,重组蛋白,利用基因工程方法在宿主中表达的外源性蛋白。,利用有机化学的方法合成，多数只能合成55个氨基酸以下的肽链,,重组蛋白表达,中心法则告诉我们：既然蛋白质的全部氨基酸信息都包含在DNA序列中，所以我们可以利用DNA来合成蛋白。我们可以利用宿主的中心法则系统，合成包括一些宿主本来根本不存在的蛋白，即重组蛋白。,,重组蛋白表达大致过程,包括基因获取以及构建，宿主的转化或者转染，以及最后的蛋白质收集。,,启动重组蛋白表达,1. 原料-需要有正确而且完整的编码蛋白质的DNA的序列； 2. 工厂-需要有将DNA转录翻译的宿主系统，并处于正常工作中，将DNA序列正确加工成蛋白质产品；,,常用的重组蛋白表达体系,原核体系（工程杆菌-改造大肠杆菌）； 昆虫体系（天蚕蛾sf9,high5细胞）； 哺乳动物体系：（仓鼠卵细胞CHO，人囊胚肾细胞Hek293等）；,CHO细胞-赢润细胞库,工程杆菌-赢润基因库,,为何选原核表达,为什么选大肠杆菌做原核系统的蛋白质表达？ 容易克隆与基因改造；生长迅速，表达快速； 培养容易而且非常廉价；,大肠杆菌菌落-固像培养,大肠杆菌菌液-液像培养,,适应大肠杆菌中心法则,保证DNA不被降解能够随着细菌的增殖而同时被扩增（可复制）； 保证质粒在在细菌生长时不能丢失（不丢失，不出错）； 能够正确被大肠杆菌宿主翻译体系识别得到翻译正确蛋白质（可转录）。,,载体,载体能够承载靶蛋白的DNA序列，并使该基因的转录和翻译完全能配合宿主系统，即被大肠杆菌识别。同时保证靶蛋白的基因序列可扩增，可复制，可表达。,,原核表达载体一般构架,复制启动子Ori，保证质粒在细菌中复制（可复制）,抗生素抗性基因，生长抗性压力下的细菌必须拥有质粒（不丢失),转录起始，核糖体结合位点,,Figure 1: Diagram of the pGEX expression vector.,pGEX-系列载体,同样拥有启动子Ori（可复制）抗性基因（不丢失）及转录lac基因（可转录）。,,常见的原核表达载体,pGEX系列，包括pGEX-KG,pGEX-4T-2等 pET系列，包括pET-15b，pET-22a，pET-42a等； pDEST pMAL系列； pBAD系列：,,常见的原核载体,pTYB1，pMAL, pET28-b，pET-20b(+)，pRSFDuet-1，pRset-a ，pGEX-4T-2，pGEX-KG，pQE9, pBAD-his等原核表达载体，能够满足各种不同的需求。 如果有兴趣了解更多原核载体可以查询： 赢润载体库:/,,如何得到更高效表达,高效的噬菌体RNA聚合酶以及噬菌體启动子,,何谓噬菌体,噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称。 T7噬菌体其能够侵染大肠杆菌，并快速的在大肠杆菌中进行复制，并利用大肠杆菌高效的表达自身的蛋白，而抑制大肠杆菌自身的蛋白质合成。,,T7噬菌体,T7噬菌体侵染大肠杆菌后，可以看到大肠杆菌自身的蛋白质表达完全停滞。,噬菌体浸染大肠杆菌的时间,,噬菌体高效表达自身蛋白原因,T7启动子活性非常高； 噬菌体的转录活性非常高，拥有特定的DNA序列； 因此两者结合，能够达到高效表达蛋白。 因此Novagen公司就开发出一系列的pET(T7)系列的载体。这个体系有时候重组蛋白都可以达到细菌自身的一半以上。,,细胞,分离,提纯,分离原料从何处来?,我们需要的特定蛋白如何与其它杂质分离？,分离得到粗蛋白之后，我们如何进一步提纯？,蛋白质分离纯化流水过程,得到含有重组蛋白的细胞之后，我们如何从中得到蛋白？,,细胞裂解,细胞裂解是为了将含有重组蛋白的分成释放到可溶性的溶液中； 常用方法： 反复冻溶 超声仪破碎； 碾磨破碎；,,如何分离与捕捉蛋白？,目的蛋白留下,含有10000种蛋白的粗提物,其它无关蛋白弃去,,性质差异分离蛋白,,蛋白质的捕捉,为了从液像中捕获蛋白，我们通过固象的琼脂糖(sepharose)介质偶联特异性基团，就可以制成不同性质的纯化填料，捕捉不同特性的蛋白质。,,疏水层析,包括疏水层析(Phenyl-SepharoseTM 6 Fast Flow)，,,阴阳离子交换层析,包括Q阴离子交换，以及SP阳离子交换层析,,阴阳离子交换层板洗脱目的蛋白质,阴阳离子交换层析,,分子量大小分离蛋白质,分子筛可以用于分离分子量大小不同的蛋白质,,亲合层析,通过特異性的标签肽或蛋白，包括GST,His，使得目的蛋白能够与蛋白柱特异性的结合。,,Example: GST - Glutathione GST-tagged proteins bind to gluthatione on beads Non-specifically or weakly bound proteins washed off GST-tagged proteins eluted with glutathione (competitor) or thrombin (protease),GST亲合层析,,利用蛋白特性亲合纯化,如NADPH偶连的层析柱能够捕捉NADPH结合的蛋白质； 如钙磷ATP柱能夠特異性的捕捉與ATP结合的蛋白激酶； 金黄色葡萄球菌蛋白Protein-A可以特异性的结合抗体，并用于抗体蛋白的分离与纯化。,,三种蛋白质层析的检测,,Protein mixture applied to column Solvent (buffer) applied to top, flowed through column Different proteins interact with