基因工程1ppt课件

基因工程技术,QQ:77280200 重庆大学,主讲: 曹 月 青,参考书目,基因工程，杨汝德，华南理工大学出版社 基因工程概论，张惠展，华东理工大学出版社 分子克隆(第三版)，J. Sambrook et al. ，科学出 版社（具体的实验方法，分子生物学研究的圣经） 基因工程原理，吴乃虎编，科学出版社（侧重 原理） 现代基因工程技术导论，陈章良编，科学出版 社（侧重应用）,主要内容,基因工程概述 基因工程的常用工具酶 基因工程的常用载体 目的基因的提取 目的基因与克隆载体的体外重组 重组克隆载体的转化 重组子的筛选、鉴定和分析 外源基因的表达 表达产物的分离纯化,第一章 基因工程概述,重组DNA技术与基因工程的基本概念 基因工程的特点与基本步骤 研究背景 基因工程的研究与发展 基因工程的分子生物学原理 基因工程的支撑技术,主要内容,(一) 基本概念,重组DNA技术是指将一种生物体的基因（供体） 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,1、重组DNA技术,基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）； 下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,2、基因工程,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,实质,基因重组,可按人们意愿进行设计和控制 是人工的、离体的、分子水平上进行的遗传重组 能在动植物和微生物间进行任意的、定向的超远源杂交,(二) 基因工程的特点及步骤,1、特点,（6）进一步对获得的目的基因进行研究和利用。 比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等,2、基本步骤,目标基因的获取,（2）基因运载体的分离纯化,（3）重组DNA分子的形成,（4）重组分子转入受体细胞,（5）重组子的筛选、鉴定和分析,基因工程的基本流程,重组DNA技术与基因工程的基本概念 基因工程的特点与基本步骤 研究背景 基因工程的研究与发展 基因工程的分子生物学原理 基因工程的支撑技术,主要内容,一般认为 1973年是基因工程诞生的元年 上世纪40年代70年代初分子生物学领域 理论上的三大发现 技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。,(三) 基因工程产生背景,1. 发现DNA是遗传物质,Oswald Theodore Avery 18771955,光滑型注入小鼠体内，小鼠死。 粗糙型注入小鼠体内，小鼠活。,将加热杀死的光滑型与粗糙型 一起注入小鼠体内，小鼠死。,从加热杀死的光滑型提取DNA， 将DNA与粗糙型混合后，注入小鼠体内，小鼠死。,光滑型加热杀死，再注入小鼠体内，小鼠活。,(三) 基因工程产生背景,2. DNA双螺旋模型的提出,Watson 和Crick,荣获了1962年的诺贝尔奖。,DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，解决了基因自我复制和传递过程，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。,不同密度的DNA分子经 平衡密度梯度离心后形 成的DNA带。,半保留复制 Matthew Meselson,半不连续复制,(三) 基因工程产生背景,3. “中心法则”的提出,以Nireberg等为代表的一批科学家经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。,遗传信息的一般流动方向（图中红线所示）： 遗传信息可以从DNA流向DNA，即完成DNA的自我复制过程； 从DNA流向RNA，进而流向蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译过程；,在某些病毒中，RNA也可以自我复制，并且还发现在一些病毒 蛋白质的合成过程中，RNA可以在逆转录酶的作用下合成DNA。,原核生物的基因调控操纵子模型,1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob提出原核基因调控的操纵子模型。,操纵子: 细菌的一个完整表达单位， 包括：调节基因,启动基因，操纵基因，结构基因。,乳糖操纵子模型,60年代，中心法则和操纵子学说以及遗传密码的成功破译，阐明了遗传信息流向和表达问题。,一般认为 1973年是基因工程诞生的元年 上世纪40年代70年代初 分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。,1967年，世界五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。,(三) 基因工程产生背景,1.工具酶的发现和应用,(三) 基因工程产生背景,1970，Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972，Boyer等发现了coR I 一类重要的限制性内切酶。,1.工具酶的发现和应用,1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。,1.工具酶的发现和应用,(三) 基因工程产生背景,(三) 基因工程产生背景,2. 基因的合成和测序,60年代，DNA及蛋白质序列分析技术出现，使基因分析和合成成为可能。,3、载体的发现及其应用,(三) 基因工程产生背景,1972年，美国Stanford大学的P. Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组。,3、载体的发现及其应用,(三) 基因工程产生背景,1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。,Cohen等的重组实验示意图,Tcr,Kmr,基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化，标志着基因克隆技术的诞生。,重组DNA技术与基因工程的基本概念 基因工程的特点与基本步骤 研究背景 基因工程的研究与发展 基因工程的分子生物学原理 基因工程的支撑技术,主要内容,(四) 基因工程的研究与发展,基因工程与医药卫生 基因工程与农牧业、食品工业 基因工程与环境保护,1.基因工程与医药卫生,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。 微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,基因工程胰岛素,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,胰岛素分子结构,基因工程胰岛素,胰岛素生产车间,1978年，美国人，人胰岛素基因； 1982，美国EliLilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。,每2000L培养液 产生100g胰岛素,100Kg胰腺 4-5g的胰岛素 2000L培养液 100g胰岛素,基因工程干扰素,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。,干扰素生产车间,干扰素分子结构,基因工程干扰素,基因工程人干扰素-2b（安达芬） 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素-2b。,1980年，美国/瑞士人，a干扰素基因。,其它基因工程药物,除胰岛素、干扰素外，还有白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品，以及预防乙肝、狂犬病、百日咳、霍乱、伤寒、虐疾等疾病的各类疫苗。,基因诊断与基因治疗,运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因,可“一次性”解除病人的疾苦。,我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞,SCID的基因工程治疗,重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。,SCID患者生存在无菌环境中,基因治疗SCID的过程,2. 基因工程与农牧业、食品工业,运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。,利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料,利用植物生物反应器生产医用蛋白,利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂,利用植物生物反应器生产工业原料,植物转基因技术在植物品种改良中的应用,控制果实成熟的转基因植物,抗病虫害的转基因植物,抗除草剂的转基因植物,改变花卉形状和颜色的转基因植物,抗环境压力的转基因植物,产高品质产物的转基因植物,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,转鱼抗寒基因的番茄,不会引起过敏的转基因大豆,含有胡萝卜素的金色大米,Science 2000: Vol. 287. no. 5451: 303 - 305,含抗除草剂基因的水稻,荧光基因工程,转基因鱼,生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国),转基因牛,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),超级动物,导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠,特殊动物,导入人基因具特殊用途的猪,3. 基因工程与环境保护,基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来。,基因工程在环境监测上的应用,利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况。,基因工程在环境监测上的应用,基因工程与环境污染治理,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,为深入研究基因的结构与功能提供了可能。 搜集、分离、鉴定生物信息资源。 为人们获得大量重组的蛋白、疫苗药物提供了可能。 为人们进行不同物种之间的基因传递提供了可能，设计构建新物种。 转基因动植物-“生物工厂”。,(五) 基因工程的研究意义,(六) 基因工程的分子生物学原理,(七) 基因工程的调控,提高外源基因的剂量。（增加拷贝）复制阶段调控。,重组基因表达的转录调控元件 如：启动子、增强子、终止子等。,蛋白质生物合成的翻译调控元件 如：SD序列、mRNA非编码区、密码子,(八) 基因工程的支撑技术,聚合酶链反应（PCR）技术 核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术,第二章 基因工程的常用工具酶,主要内容,限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 单链核酸酶内切酶 核酸外切酶,(一) 限制性核酸内切酶,1、基因的剪刀（简称限制酶） 限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一类酶，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列, 并在特异位点切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。,2、限制酶的来源,从原核生物中提取纯化，大小不等（175-1250 AA） 现已分离出3000种，可识别250种不同的序列。,细菌自身的DNA为什么不被降解？,50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象,E.O.P 成斑率 efficiency of plating,酶切位点 不被修饰,噬菌体DNA 被切割,酶切位点 被修饰 Methylation,基因组DNA 不被切割,限制修饰的酶学假说,固有的甲基化酶使其自身DNA受到保护，甲基化 位点与其含有的限制性内切酶识别位点相同。,限制和修饰：保护自身DNA； 破坏外来DNA使之降解。,1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶； 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。,3、限制酶的种类,1. 限制修饰活性 2. 内切酶的蛋白 质结构 3. 限制辅助因子 4. 切割位点 5. 特异性切割 6. 基因克隆中,I 型 多功能酶 3种不同亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 距特异性位点1000bp 不是 无用,II 型 限制酶和修饰酶分开 单一成分 Mg2+ 特异性位点及其附近 是 非常有用,III 型 双功能酶 2种亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 特异性位点3端24-26bp处 不是 无用,4、限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名 Haemophiillus infflluenzae d 嗜血流感杆菌d株 H i n d III 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶，按发现顺序编排。 属名（大写）；种名两个字母（小写）；株名;发现顺序（罗马字母）。,5、型限制性内切酶特点,特异性,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸 序列（靶序列） ，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,特异识别和序列有关，与DNA来源无关, 对DNA普遍适用。,识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列: EcoRI 5 GAATTC 3 HaeI 5 (A/T)GGCC(A/T) 3 MboI 5 GATC 3 NotI 5 GCGGCGCGC 3 AsuI 5 GGNCC 3,识别序列具有回文结构 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧； 识别切割序列呈典型的双重旋转对称型回文结构；,EcoR I的识别序列和切割位点,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸， 他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,切割后可形成平末端或粘性末端,平头末端： 限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链，形成的双链末端。 具有平头末端的DNA片段不易重新环化。,推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。 据此推算，一条49000bp长的DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现频率并不均等。,识别位点在DNA分子上出现的频率,切割平均大小4N (N为识别碱基数目),6、核酸内切酶的反应条件,7 、 酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10X) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L Volume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,8、酶切的注意事项,酶切的注意事项,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的3 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,酶切的注意事项,DNA样品的纯度： 蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 酶的用量 反应总体积 反应时间 反应温度 pH,星号活性,在非理想的条件下，内切酶切割与识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，这一现象称星号活性（Star activity）。,酶切的注意事项,通常在酶的右上角标星号，如EcoR I,产生星号活性的原因,较高的甘油浓度（5% v/v）（1/10）； 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100 U/g）； 低盐浓度（pH 8.0） 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等） 用其他二价离子替代镁离子（如Mn+，Cu+，Co+，Zn+等）,抑制星号活性的方法,尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。 将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。 将反应缓冲液的pH值降到7.0。 二价离子用Mg+。,来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸序列，这类酶为同裂酶。 切点位置可不同或相同。 同裂酶产生同样的切割时，形成同样的末端。,9、 同裂酶,对切割位点的甲基化敏感性不同。,来源不同，识别序列不同，但产生相同的黏性末端。,10、同尾酶,Tsp509I AATT TTAA EcoRI GAATTC CTTAAG,同尾酶酶解片段能够通过其粘性末端之间的互补作用重新结合，在连接酶的作用下，体外重组得到异源二聚体，重新结合的位点为杂合位点。 杂合位点通常不能被该两种酶的任一种所识别。,BclI,Bgl II,（二）DNA连接酶,1、DNA连接酶基因的针线,DNA连接酶：能将两段DNA（黏性末端或平末端）拼接起来。,2、DNA连接酶的发现,环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种Nick的酶存在。 1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶DNA连接酶（ligase）。,3、连接酶作用特点,游离的3羟基（-OH）和5磷酸基（-P）,3羟基（-OH）和5磷酸基（-P）彼此相邻,作用于DNA双链分子,封闭单一磷酸二酯键缺口。,吸能反应，需要ATP或NAD+。,A,B,4、连接酶种类,T4噬菌体DNA连接酶 可用于粘末端和平末端连接；需要ATP辅因子 ； 大肠杆菌DNA连接酶 只作用于粘末端；需要NAD辅因子； 热稳定DNA连接酶 寡核苷酸探针之间，作用温度85度，降低非特异连接；,5、连接酶反应条件,如EcoRI酶切后，连接后的重组分子中仍 有 两个EcoRI切口，用 EcoRI仍可将接上去的片段切下来，接上去的片段的极性有两种可能。,6、各种连接反应,同种酶产生的粘性末端的连接,如用EcoRI和BamHI切割，重组分子仍可 用EcoRI和BamHI切下，接上去的DNA片段极性只有一种可能性,不同种酶产生的粘性末端的连接,如同尾酶切后的连接，由此得到的重组 分子既不能用二者中任何一种切开，如 BclI和Bgl II 。,不同种酶产生的同种粘性末端的连接,BclI,Bgl II,7、 影响连接效率的因素 A. 温度（最主要的因素） B. ATP的浓度( 10M - 1M ) C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段的摩尔比,8、连接反应注意事项,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,9、DNA连接的策略,DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶。能够把dNTP连续加到双链DNA分子3-OH，催化核酸的聚合作用。 聚合活性；模板依赖性；,（三） DNA聚合酶,常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶大片段 T4和T7噬菌体编码的DNA聚合酶 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 耐热DNA聚合酶（Taq DNA酶）,催化活性需要的条件： dNTPs Mg2+ 3-OH游离基团引物链 单、双链DNA模板,1、大肠杆菌DNA聚合酶,是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌中 分离出来的。它是一种多功能性的酶。,主要有3种作用： 53的聚合作用。, 53外切酶活性。 切除受损伤的DNA； 分解 RNA/DNA中的 DNA。, 35的外切酶活性。 作用底物：带3-OH的双链或单链DNA 消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸;,大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途,A. 制备高比活度的DNA探针 利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA连接后的大缺口填充 利用5-3的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5-3的聚合酶活性。,切口平移 当双链DNA的一条链产生缺口时，DNA聚合酶I 的53聚合活性将dNTP加到3-OH端，与此同时，5 3外切活性从5端切除原有的核苷酸，使切口沿DNA平移。,大肠杆菌聚合酶I的应用示例,大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处 理后产生的大片段酶分子。 主要有2种作用： 53聚合酶活性和35外切酶活性； 无53外切酶活性,2、Klenow片段,1、形成平末端 当用限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，要与平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。 2、用于填补DNA单链末端成为双链 如果供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。 3、合成cDNA第二链 4、 DNA序列的测定,Klenow片段用途,3、T4噬菌体DNA聚合酶,从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中分离出来的。,它和Klenow片段一样具有53的聚合酶活性 和3 5 的核酸外切酶活性。 外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。,53聚合酶活性 有dNTP时，聚合活性。 35外切酶活性， 活性比Klenow强200倍。 （无dNTP存在）。,T4DNA聚合酶还有第三种活力取代反应。 如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 5 外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出和存在的那种dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。,T4DNA聚合酶的用途,1、以填充反应标记有5端延伸的双链 DNA片段 2、以取代反应标记延伸末端或平头末端 的双链DNA片段 3、用于DNA序列分析,53聚合酶活性，丧失了35外切酶活性 用于测序的工具酶,4、修饰的T7噬菌体DNA聚合酶,5、 Taq DNA聚合酶 耐热性很高的聚合酶，反应温度75-80度， 用于PCR反应中DNA的扩增。需要Mg2+。 53的聚合作用； 无35， 53外切酶活性。,其他DNA聚合酶 高保真DNA聚合酶（具有35外切活性，校对功能）。 长片段DNA聚合酶（扩增几kb至几十kb的片段）,反转录酶是RNA指导的DNA聚合（cDNA， complementary DNA）酶。 逆转录酶首