转基因动物与生物反应器

第 十 章 转基因动物与生物反应器,10.1转基因技术,基因工程技术： 按照人们的意愿，重组DNA（一种生物DNA中的遗传密码片段连接到另一种生物的DNA链上），设计新的遗传物质，创造新的物种。 转基因技术：通过人工操作的方法将外源基因整合到生物体基因组内，使该转基因生物能稳定地表达并将此基因遗传给后代的实验技术。,10.1.1 细胞转染外源基因的方法,常用的哺乳动物细胞转染（接受外源基因）的方法有两种： 1. 暂时转染：质粒在宿主细胞内不必停留很长时间，DNA转录成mRNA，翻译成蛋白质，并不进入基因组。如磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体载体发等。 2. 永久性转染：逆转录病毒载体法可产生永久有效的转染。,10.1.1 细胞转染外源基因的方法,基因转移的方法：物理、化学和生物方法。 一、物理方法 1.电穿孔法： 利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔。从而使外源DNA不经过胞饮作用直接转移至细胞中。 2.微注射法：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，处死雌鼠取出受精卵。借助显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内，将受精卵移植到另外一只假受孕的母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。,10.1.1 细胞转染外源基因的方法,3.裸露DNA直接注射法 将裸露DNA直接注射到组织中，DNA有可能直接被细胞所摄入。 最简单，但效率低。,二、化学方法生 1、DEAE-葡聚糖法 将外源DNA片段与DEAE葡聚糖等高分子碳水化合物混合，这样DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正电荷基团上。 2.磷酸钙-DNA共沉淀法：磷酸缓冲液（pH7.1）溶解DNA，加氯化钙，磷酸钙与DNA共沉淀形成大颗粒。通过钙、磷诱导细胞吞噬或脂相收缩的空隙，DNA进入细胞。 3.脂质体载体包埋法：人工膜泡（载体）包裹DNA，与受体细胞融合。,10.1.2 转染细胞的鉴定,可设计含有抗药性基因的外源DNA载体，然后通过选择性培养基进行转染细胞的筛选。 也可通过提取转染细胞的DNA，以适当限制性内切酶酶切后进行Southern转移分析，检验细胞中是否有被转移的外源基因。,10.2 转基因动物,转基因动物（transgenic animal）： 在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地表达和遗传给后代的遗传工程动物。,10.2.1 发展历史,1974年，贾英利斯和明茨应用显微注射法，在世界上首次获得AV40DNA转基因小鼠。 1980年，戈登等人首次育成带有人胸苷激酶基因的转移小鼠。 1982年，帕尔米特等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通对照小鼠生长速度快24倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”。 随后的几十年里，转基因动物技术飞速发展。,10.2.2 转基因动物的制备,一、原理与方法 生产转基因动物的关键技术： 外源目的基因制备； 外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞； 选择获得携有目的基因的细胞； 选择合适的体外培养系统和宿主动物； 转基因细胞胚胎发育及鉴定； 筛选所得的转基因动物品系。,10.2.2 转基因动物的制备,方法： 1. 原核期胚胎显微注射法 2. 反转录病毒感染法 3. 胚胎干细胞方法 4. 精子载体法：精子与DNA混培养，精子携带DNA进入卵子 5. 人工酵母染色体法：百万碱基对的巨大基因，整合率较高 6. 受精前卵细胞显微注射法 7. 其他方法：电脉冲法、染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、基因剔除、基因嵌入等,3种转基因的方法及其与发育阶段的关系：,DNA,反转录病毒感染或DNA转染或电转移,胚胎干细胞,显微注射,囊 胚,受精卵,四细胞期,原肠胚,转基因动物,DNA,显微注射,DNA,反转录病毒感染,转基因动物鉴定技术： 早期采用的、也是目前最有权威性的转基因动物鉴定技术是Southern blot。提取待检动物组织的染色体消化后电脉，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。 斑点杂交：提取动物DNA，点于硝酸纤维素膜，探针杂交，放射自显影。 聚合酶链式反应（PCR）：PCR扩增产物序列分析即可鉴定。 染色体原位杂交：（？）,目的基因的制备,目的基因的来源 1.采用限制性内切酶，从基因细胞中获取目的基因 2.通过mRNA合成cDNA 3.人工体外合成DNA片段 4.聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段,目的基因的克隆 1.通过载体在适当的宿主中克隆 （1）基因克隆的载体 载体的选择与改造应具备： 提供在适当宿主细胞中复制的信号，或能整合到宿主 染色体上与基因组一起复制； 有增殖非必须的DNA区域，并含单个内切酶位点， 以便外源DNA共价连接（插入或取代该区段），形成重 组子可在宿主细胞内复制和增殖； 分子量不宜过大，以便于DNA体外操作； 载体DNA易与宿主核酸分开，便于提纯； 具有筛选标记，以区别阳性重组子和阴性重组子， 选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型、形成 噬菌斑的能力等。,目的基因的克隆,（1）基因克隆的载体 质粒载体： 质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。 噬菌体载体： 噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约有50kb，在噬菌体颗粒中分离出来的DNA为线性双链分子，在分子两端各有12个碱基的互补单链顺序，是天然的粘性末端。,粘粒载体：由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成。由于噬菌体载体容量仍受一定限制，最大插入片段不能超过23kb。 粘粒载体：质粒复制起始位点、1个或多个限制性内切酶位点、抗药性标记、带有粘性末端的DNA片段。大小46kb，插入2945kb。,（2）目的基因与载体DNA间的连接 1）粘端连接反应方法 2）平断连接反应方法 （3）重组载体导入受体细胞 氯化钙转化法 2.通过PCR反应克隆目的细胞 在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。,10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展,转基因动物技术的意义： 1、建立人类疾病动物模型； 2、加速动物育种； 3、研究真核生物基因表达调控机理； 4、哺乳动物特异组织系统生产人用药用蛋白、细胞、组织、器官。,10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展,优良动物育种： 1. 快速生长与肉质改善 2. 抵抗疾病 3. 增加羊毛产量和性能 4. 抗冻品种培育,10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展,在医药领域的应用： 1. 抗出血性药物 2. 抗凝血药物 3.血栓治疗药物 4.肺气肿治疗药物 5.免疫治疗药物 6.人型化单克隆抗体,10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展,生产用于人体器官移植的动物器官： 尚处于研究阶段猪：生殖、生理特点适宜，器官大小、解剖生理特点与人相似，组织相容性抗原的同源性较高。 1. 建立异种抗原缺失或其表达水平低下的转基因猪 2. 建立HLA转基因猪 3. 建立人补体调节蛋白CD55、CD59等转基因猪,10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展,基因（或细胞）治疗：转基因动物为人类疾病基因治疗提供实验依据、模型。,10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展,基因打靶： 转基因动物的类型： 1、外源基因随机插入基因组； 2、基因组中特定内源基因定点突变基因剔除 3、基因组中特定内源基因定向重组基因替换 基因打靶：2和3。,转基因动物研究的最新进展 1. 转线粒体动物 2. 逆转录病毒载体注射M期的卵细胞 3. 精子与外源基因合并注射卵母细胞,10.2.3 转基因动物技术的意义与最新进展,10.2.3 转基因动物应用面筋的问题,1、目的基因整合与表达效率低（宿主基因突变） 2、转基因动物的负面影响 3、费用高,10.3 转基因生物反应器,转基因生物反应器经历了三个发展阶段： 细菌基因工程；细胞基因工程，转基因动物。 生物反应器主要包括： 转基因微生物生物反应器，转基因植物生物反应器，转基因动物生物反应器。,10.3.1 转基因微生物反应器,微生物结构简单、繁殖迅速、容易培养等特点，而成为良好的转基因对象。 细菌或细胞基因工程的生物反应器：基于传统发酵工程技术 ，细菌或动植物细胞，通过高密度发酵培养，分离纯化获得所需要目的产物，由此逐渐形成第一代基因药物。,10.3.2 转基因植物反应器,基因工程使得植物体正在成为具有重要经济价值的异源蛋白的生物反应器。 据不完全统计，迄今为止，国内外已经有几十种药用蛋白质或 多肽在植物中得到成功表达，其中包括人的细胞因子、表皮生长因子、促红细胞生长素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等。,10.3.3 转基因动物反应器,动物乳腺生物反应器 乳腺生物反应器的原理： 通过转基因动物的技术方法，将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白。 应用： 改良乳汁； 药用蛋白。,10.4 转基因技术存在的问题与最新进展,存在问题： 1. 外源基因表达效率低和遗传丢失 2. 转基因技术尚不成熟 3. 转基因动物成活率低及其后遗症 4. 转基因动物模型与预期不符 5.转基因动物生物反应器产品的安全问题 6. 传统观念与伦理挑战：心理、有害转 基因动物（至今未见向