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酶解鸡粪制取氨基酸液及制备氨基酸螯合钙的工艺研究摘 要鸡粪是一种廉价的蛋白质来源，其氨基酸含量丰富，具有很高的利用价值。积极开发氨基酸资源及综合利用蛋白质资源已受到广泛重视。本研究以鸡粪为原料，探索优化的水解方法及水解条件，制备出氨基酸含量较高的氨基酸液，将其作为合成氨基酸螯合钙的原料。采用酶水解法制备氨基酸液并确定最佳工艺，对胰酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等四种酶进行了比较，实验结果表明胰酶的水解效率高于碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶。影响酶水解因素的作用分别是pH水解温度水解时间酶用量，在优化条件下用胰酶水解鸡粪得出水解的最佳工艺条件：胰酶水解鸡粪制备氨基酸液的最适pH为8.5，最适温度为40，最适酶量为2.0%，时间为14h。将氨基酸液与骨渣中提取的可溶性钙相螯合。在氨基酸螯合钙的合成反应中，考察了pH值、反应时间、氨基酸液浓度对反应的影响。选出氨基酸液与可溶性钙做螯合工艺质量最适配比。单因素实验和正交实验的结果显示，pH值是影响反应的最主要因素，氨基酸液浓度与反应时间也对螯合反应有一定的影响，而温度的影响较小。制备复合氨基酸螯合钙的最佳工艺条件为：在50下，pH值为9，时间50min，氨基酸与钙的质量比为4:1时产品得率最高，螯合率为81.36%。关键词：鸡粪；发酵；利用；复合氨基酸螯合钙；螯合前 言1鸡粪再生饲料蛋白的加工与利用随着我国畜牧业生产集约化、商品化程度的不断提高，大中城市郊区的畜禽粪源急剧增加，若处理不当，将造成重要的环境污染。我国是以谷物为主食的国家，畜牧业发展过程中，蛋白质资源日趋紧张，植物蛋白质的必须氨基酸的配比也不太理想，充分利用畜牧业生产集约化的有利条件，合理、科学的开发与人类不争口粮的非常规饲料添加剂以替代常规饲料添加剂，不仅可以缓解养殖业蛋白饲料紧缺局面，降低饲养成本，还可以减少环境污染，保护生态平衡，具有良好的经济、生态和社会效益1。畜禽粪便中，营养价值最高的是鸡粪。由于鸡的消化道很短，仅为其体长的7倍，而牛、羊的消化道为体长的30倍。因此，鸡对饲料的消化率很低。鸡粪是一种廉价的蛋白质饲料来源，鸡粪的粗蛋白含量几乎比动物进食的饲料中的粗蛋白高52%，将鸡粪作为饲料开发利用意义重大。但是，目前社会上对鸡粪再生饲料蛋白褒贬不一，一方面从肉食品安全角度表示怀疑。担心用鸡粪作饲料会导致疾病的传播2,3。另一方面从粪便的资源化、无害化处理和综合利用上主张积极推广。在肉食品安全性尚无定论之前，笔者赞同第二种意见。我国的饲料资源不足。特别是蛋白质饲料资源匮乏，用鸡粪作为饲料蛋白资源，可以节省大量粮食，缓解人畜争粮矛盾。鸡粪经过无害化加工处理用作再生饲料添加剂，有利于环境保护。可在不同程度上减少粪便中有害物质向自然界的排放、将对农业可持续发展和农产品质量的提高带来良好的效果。迄今为止尚无鸡粪中残留的微量激素活性和其它成分对采食这种粪便的动物或随后再食这些动物产品的人构成什么威胁的相关报道。1.1鸡粪的成分及营养价值鸡的消化道较短，很多营养成分未得到消化，就随粪便排出体外，其消化利用率一般为35%左右。其中主要包括粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维、无机盐和游离氨基酸等(见表1) 。由表l可知4，鸡粪中粗蛋白含量较高，一般为20%40%，高于一般的能量饲料中的粗蛋白含量，几乎与大豆相当。但鸡粪的粗蛋白中非蛋白氮可占45%左右，主要是尿素、尿酸等，不能被单胃动物利用。不过反刍动物瘤胃内的微生物可直接利用这些非蛋白氮，合成菌体蛋白，其消化率85%左右。鸡粪经发酵处理后，非蛋白氮可被微生物利用合成菌体蛋白，从而被单胃动物利用5,6。鸡粪蛋白质的氨基酸组成也较完善，几乎包括所有的动物必须氨基酸(见表2) 4。必须氨基酸比玉米、大麦和高粱等谷实类饲料高出1.5倍。因此，对鸡粪进行适当的加工处理，可以让其成为较好的饲料资源。鸡粪的化学组成与日粮组合，鸡的品种及发育阶段的不同而各异。鸡粪的营养成分以雏鸡的粪便养分最高，后备鸡和产蛋鸡的粪便养分较低，笼养鸡比平养鸡养份含量高(见表3)。表1 鸡粪的化学成分(按干物质计算)Table1 The chemical composition of chicken manure (by dry matter basis)成分Composition鲜鸡粪Fresh chm（%）干鸡粪Dried chm（%）成分Composition鲜鸡粪Fresh chm（%）干鸡粪Dried chm（%）成分Composition鲜鸡粪Fresh chm（%）干鸡粪Dried chm（%）粗蛋白crude protein46.8724.28铜copper0.0068-甲腺氨酸thyronine-0.60粗脂肪crude fat2.644.07铁iron0.0560-缬氨酸valine0.340.83粗纤维crude fiber18.1210.11精氨酸arginine0.260.53谷氨酸glutamic acid1.041.69灰分Ash22.7335.79甘氨酸glycin1.680.93丙氨酸Alanine0.531.07钙calcium5.1210.61组氨酸histidine0.130.19酪氨酸tyrosine0.240.40磷phosphorus3.422.71异亮氨酸isoleucine0.350.66胱氨酸cystine0.000.21镁magnesium0.31-亮氨酸leucine0.440.94丝氨酸serine0.430.72钾kalium1.682.37赖氨酸lysine0.280.56天门冬氨酸aspartic acid0.781.22钠natrium0.24-蛋氨酸methionine0.110.29苏氨酸threonine0.360.60锰manganese0.0276-苯丙氨酸phenylalanine0.280.53脯氨酸proline0.33-注：Vuori等(1977)；EL Boushy 等(1977)表2 常用饲料同鸡粪粗蛋白及氨基酸含量对比表Table 2 The comparison of amino acids content in the common feed and chicken manure crude protein检测项目鸡粪玉米高粱大麦小麦碎米甘薯干米糠小麦麸豆饼花生饼鱼粉粗蛋白12.38.48.611.012.011.03.012.513.744.038.853.6蛋氨酸0.170.150.100.180.140.200.040.200.180.600.221.18赖氨酸0.440.310.300.530.300.500.140.500.512.901.243.49苏氨酸0.430.370.300.360.280.300.120.200.301.700.803.09异亮氨酸0.470.280.500.420.430.300.290.400.362.500.994.10组氨酸0.230.250.300.230.200.200.060.300.351.100.842.00缬氨酸0.470.420.500.620.480.700.140.680.582.401.203.60亮氨酸0.761.271.500.080.60-0.171.100.783.401.835.00精氨酸0.300.390.400.500.400.600.091.001.073.203.474.49苯丙氨酸0.760.420.500.620.490.400.120.400.502.201.464.56甘氨酸1.740.300.300.360.500.700.131.000.902.401.614.00氨基酸总 和5.774.164.703.903.823.901.305.785.4722.413.935.5必需氨基酸总和3.032.803.22.902.231.700.882.802.5713.36.5421.4注：表中常用饲料氨基酸含量来自艾文森蛋鸡生产一书表3 各种鸡粪营养成分对照表(-T基计)Table 3 Comparison of various chicken manure nutrition (-T based account)项目粗蛋白粗脂肪粗纤维粗灰分无氮浸出物雏鸡粪37.55.910.012.044.6肉鸡粪33.64.013.516.632.3蛋鸡粪19.02.311.440.526.3注:表中各种鸡粪营养成分来自艾文森蛋鸡生产一书1.2 鸡粪的转化研究从化学成分看，鸡粪虽具有较高的营养价值，但鸡粪中既含有蛋白态氮外，还有氨、尿素、尿酸、肌酸等非蛋白态氮素化合物。这些化合物不但难以直接被吸收利用，而且有的还有毒。同时，鸡粪中还带有寄生虫和病菌等，因而鸡粪需经转化、除虫、杀菌、去毒、除臭味后方可作利用。鸡粪经一定处理作饲料已有较多的研究 ，常用的有物理处理、化学处理、微生物发酵3种方法，物理与化学方法操作简单，但鸡粪营养损失大，粗蛋白中的非氨基氮未得到有效转化。微生物发酵法，一方面可使营养损失减小，另一方面可使非氨基氮重建为氨基氮7。某些低等生物能分解鸡粪中的物质合成生物蛋白及多种营养物质，为人类所利用。藻类能将畜粪中的氮转化为蛋白质。且繁殖速度快。沼气发酵后的厌氧发酵液倒入藻塘，藻粉可作为畜禽的饲料。蝇等食粪昆虫能有效地利用粪便，如每干克新鲜鸡粪能孵化0.51.0g蝇卵成蛹。蛹粉是良好的限制性氨基酸的来源，其氨基酸质量与肉和鱼粉相同。蛹粉是雏鸡日粮中的蛋白质、氨基酸和矿物质的丰富来源。此外，一些微生物如细菌和酵母菌通过好氧性发酵有效地利用鸡粪中的尿酸，使发酵最终产物的粗蛋白含量达50%，其氨基酸成分与大豆相似，发酵后的鸡粪是很好的畜禽饲料。微生物发酵法，一方面可使营养损失减小，另一方面可使非氨基氮重建为氨基氮。鸡粪发酵技术的研究不仅开辟了新的饲料资源，使得鸡粪通过微生物发酵处理后，转化为较好的蛋白质饲料，减少粮食消耗，降低饲养成本，缓解养殖业饲料紧缺的局面，而且避免了环境污染，有利于保护生态环境，同时也促进了养殖业的良性循环8。1.3鸡粪的应用现状 (1)农业上的应用 大约占到鸡粪总量的95%以上。鸡粪中富含氮、磷、钾等植物所必需的养分，是植物生产中优质的有机肥，优于其他畜禽粪肥。经处理过的鸡粪是营养物质全面的有机肥料，是栽培果树、叶类蔬菜、瓜类、花卉等的上佳基肥。农作物施用鸡粪，不仅可显著增加产量。更能提高收获物的品质，同时还能很好的改良土壤增加土壤的有机质和保水、保肥等性能。经消毒等处理的鸡粪，是园艺作物无土基质栽培时使用最广泛的有机基肥，其用量一般为每立方米基质中加入干鸡粪1520kg。 (2)养殖业上的应用 鸡粪干物质中约含粗蛋白25%27%、粗脂肪1.4%、无氮浸出物26.6%、粗纤维12.7%、粗灰分27.09%，此外，还富含磷、钙、B族维生素和铁、铜、镁、锰等微量元素，是加工成畜、禽、鱼的廉价粪氮饲料。也是很好的蛋白质补充饲料。应注意的是，鸡粪加工处理时都必须事先除去鸡毛、土块、木块等杂物。利用鸡粪作为饲料，虽然大量试验证明是可行的，但仍存在一些问题，如新鲜鸡粪有臭味，适口性差，鸡粪可携带各种病原体。如鸡新城疫病毒、禽流感、丹毒杆菌、沙门氏杆菌等，所以在使用时一定要进行严格的消毒灭菌处理9。目前，烘干鸡粪的应用还主要在用作肥料方面，尽管施用这种肥料的农产品内在质量好，但是还没有被大多数消费者所认识，种植者也没有因此多获利，这就使得烘干鸡粪的价格难以提高。作为饲料使用的烘干鸡粪所占比例很小，它只是在小范围内实验性的使用，还没有被饲料加工企业所接受，加上牛羊饲料加工量还比较少，因此需要有一个逐渐认识的过程。2氨基酸提取的研究2.1氨基酸的生物活性及应用氨基酸是构成蛋白质的基本单元，也是合成机体抗体，激素和酶的原料，在机体内有特殊的生理功能，是维持生命现象的重要物质。氨基酸以肽键结合而存在于各种功能与结构不同的蛋白质分子中。蛋白质是生命的基础物质，它对机体的生长、维持、防御及生理功能极为重要。迄今，氨基酸及其衍生物的品种超过100多种。应用于食品、饲料、化工、农业及医药等方面。积极开发氨基酸资源及综合利用蛋白质资源已受到广泛重视。为达到良好的蛋白质营养，必须同时供应充足而且组成平衡的各种氨基酸与能量，使细胞可以进行各种蛋白质的生物合成。在合成过程中，需要21种氨基酸（其中不包括甲基组氨酸及羟脯氨酸）。就人类营养来讲，其中8种（有称9种）为必须氨基酸（即体内完全不能合成或合成速率不能满足最适生长需要而必须由食物蛋白供给的氨基酸），其他为非必需氨基酸（即体内可从必需氨基酸或其他代谢物转变而成的氨基酸）。近年发现，几种非必需氨基酸在某些情况下也是必需的或必要的。当摄入一种完全的氨基酸混合物后，肝细胞内的蛋白质合成十分旺盛；如其中缺乏一种必需氨基酸，则合成趋于停止。在肠外营养时，已证实同时输注色氨酸与不含色氨酸的酪蛋白酸水解液，可获得正氮平衡；如将二者分开输注，则为负氮平衡。由引可见，必需氨基酸在蛋白质营养中的重要性10。2.2氨基酸提取与制备氨基酸的生产方法有4种：经典的提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶法。提取法是最早发展起来的，是生产氨基酸的最基本方法。所谓提取法是指蛋白质或以含有蛋白质的物料为原料，经酸、碱、或酶水解以后提纯氨基酸的方法。早期提取法是建立在溶剂抽提、等电点结晶和沉淀剂分离的基础上。随着离子交换树脂的应用，使氨基酸的分离更为容易，简化了提炼工序，缩短了操作时间，提高了氨基酸收率。提取法的优点是原料来源丰富，投产比较容易，但产量低，成本高，三废较严重。在国外多数氨基酸生产已逐步为微生物发酵法及化学合成法所取代。在目前4种生产方法中10，发酵法生产占主导地位。酶拆分法也占重要地位。化学合成法倾向于氨基酸衍生物的制备。酶水解提蛋白质的主要特点为（1）蛋白质的提取率高，一般均在70%以上；（2）工艺易控制，酶水解反应温度低，反应时间短，无环境污染；（3）产品理化性质好，营养价值高。提取与分离是氨基酸生产的基本技术。提取法生产氨基酸主要经过3个步骤。即蛋白质水解、氨基酸提取分离及结晶精制。在我国，具有丰富动物资源的角、骨、血、蹄、皮、毛发、羽毛及鱼鳞等，有待充分利用。目前已综合利用的有人发、猪血、猪毛、羊毛、丝素丝胶、皮革边料、蚕蛹巢丝、水产品下脚料等。近年来，国内相继报道了植物性蛋白中的玉米蛋白及大豆蛋白的酶解特性的研究11，但对鸡粪中蛋白质的酶解特性的研究报道目前尚未发现。3钙制剂研究现状3.1钙的生理作用钙在动物体内的含量仅次于氧、碳、氢、氮，同时也是含量最多的无机元素。钙对细胞的新陈代谢等生命活动起主导调控作用。缺钙会造成人体生理障碍，进而引发一系列严重疾病。临床上可发生缺钙导所致的骨质疏松、儿童佝偻病、手足抽搐症以及高血压、老年痴呆等疾病的发生。钙对畜禽的生命活动同样起着极其重要的作用，尤其禽类在产卵期间需要补充大量的钙12。3.2钙摄入情况钙是以螯合物形式被吸收的，由于微量元素(金属阳离子)需要一种载体分子将其包围起来，在细胞膜外形成一种有机的脂溶性表面，才能穿过细胞膜，而螯合物中氨基酸分子恰好对金属离子起到这种保护作用。Found13认为，位于具有五元环或六元环螯合物中心的金属离子可通过小肠绒毛刷缘。Vandergrifl14于1991年提出，金属一旦与氨基酸、肽螯合后，那么该矿物质元素在体内的吸收、代谢情况完全由与之螯合的氨基酸、肽决定。动物可以“胞饮”方式直接吸收分子量几万的高分子螯合物。钙吸收理论表明，食物中的钙源经胃液消化成钙离子，在小肠内与小肠刷状缘分泌的小分子氨基酸或短肽发生螯合反应生成氨基酸螯合钙，再被整体吸收，于细胞内自动断开，从而达到钙的沉积。氨基酸螯合钙，其充分运用钙吸收的理论，将钙与氨基酸通过配位键螯合在一起，利用小肠绒毛上皮细胞对氨基酸的主动转运过程，使钙的吸收率有突破性的提高。可见，氨基酸螯合钙是钙吸收的原始模式之一。3.3补钙产品应用现状钙制剂的选择标准是：含钙量高、水溶性大、肠道吸收度高、生物利用度好、重金属含量低无毒副作用。目前补钙原料有无机钙、有机酸钙和有机钙三类：第一类是无机钙，如碳酸钙、磷酸氢钙、氯化钙等。此类钙制剂含钙量高，但不溶于水，因大部分没有被中和，以难溶盐的形式被排泄掉，所以吸收率低，且易在肾脏停留，容易引起肾结石；第二类是有机酸钙，如乳酸钙、醋酸钙、葡萄糖钙、柠檬酸钙等。此类钙产品往往存在着含钙量低、生物体内元素之间的拮抗作用明显，溶解度较大，易溶失，价格较高等缺陷，不能满足生物体生长的需要15,16；第三类是有机钙，典型代表为氨基酸螯合钙。其具有稳定的化学性能、高的生物效价、无毒、无刺激作用、适口性好等优点，尤其是作为饲料添加剂具有易被动物体消化吸收，可提高饲料转化利用率。因此被认为是一种较理想的钙源。3.4骨粉中钙的提取我国每年在畜禽屠宰和肉类生产中产生大量骨骼，骨骼中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质、骨胶原和软骨素等营养物质17，特别是其中钙磷盐含量很高，因而利用骨资源的一个思路是将其制成骨糊和骨髓粉，作为钙磷添加剂，关于这方面的研究报道较多23，但实际应用时需有先进的技术设备，因此并不能被广泛利用。而骨胶、骨油等是骨资源利用的又一途径，它们对原材料的要求并不苛刻，且市场需求大，工艺简单易行，利用率高，故应用较广18,19。但在生产过程中，会产生大量的骨渣废弃物。以年生产1000余吨骨胶的中型骨胶厂为例，仅每年积压的废弃骨渣就有上百吨之多。这些骨渣废弃物有时被加工成骨粉作饲料用，但其经济价值远没有得到充分的利用。骨渣中含有大量的钙，成为了一种良好的钙源。但骨中离子型钙含量甚微，不仅仅因为羟磷灰石中磷酸钙和氢氧化钙(25溶解度为0.12)的溶解度低，更重要的是因为骨中羟磷灰石与胶原纤维有机结合，在外部还有水合壳的保护。因此只有水解开胶原纤维(主要成分为胶原蛋白)，才能使酸碱作用于羟磷灰石上，使骨钙转化为可溶性钙20,21。提高骨钙的溶解度，一般采用：酸解法、碱解法、酶解法。3.4.1酸解法利用酸的作用破坏骨粉中胶原纤维中蛋白质的盐键，酯键，使蛋白质变性，从而使与胶原纤维结合的羟磷灰石裸露出来，然后酸作用于羟磷灰石，让骨钙转化成可溶性钙，此法可以提高骨粉中可溶性钙的溶出率19。朱迎春17分别用盐酸、乳酸、柠檬酸、乙酸作用骨渣，盐酸提取效果最佳。在单因子试验的基础上，采用三因子二次通用试验确定了酸解的最佳作用条件为：作用1g骨粉，盐酸最佳浓度为2.75mol/L，最佳用量为1.75mL，最佳时间为57min，在这种条件下作用，可溶性钙含量为15.60%，钙转化率为53.35%。3.4.2碱解法用碱处理的目的主要是除去骨粉内外包围缠绕的蛋白质脂肪，进一步减少骨粉的粒度，从而有利于人体对钙的吸收，但是碱解法会将组成蛋白质的L-型氨基酸部分转变为D-型氨基酸，且水解过程中破坏的氨基酸比较多22，所以，此法用的相对较少。黎铭23(1998)报道了用甲鱼骨研制活性钙的方法，以NaOH和酒精(作用为脱腥、增白、脱色、提高样品溶解性)分次浸泡甲鱼骨渣，经高压烧煮、烘干、粉碎制得成品。生成的活性钙的主要成分为Ca(OH)2和CaO，活性很高30，但易与肠道中其它物质如草酸、植酸等反应生成沉淀，不利于人体吸收24,25。3.4.3酶解法采用合适的酶分解骨粉中残留的蛋白质，使骨钙充分分离出来，并与氨基酸作用生成可溶性氨基酸钙，促进钙的吸收26,27。杨桂萍(1998)等17,28确定了用木瓜蛋白酶水解骨粉的最佳工艺条件(PH=7 T=5060 t=8h)，骨粉粒径明显小于未酶解前的骨粉粒径赵瑞香(2000)等29比较中性蛋白酶、胰酶和碱性蛋白酶作用于骨粉的效果，发现用胰酶可获得最大的钙转化率，钙溶出率为2.56%，骨钙转化率为16.0%并确定了胰酶最佳用量为骨粉比胰酶：骨粉=1:10002:1000，时间为910h。宋俊梅(2002)等30用中性蛋白酶水解鸡骨粉和大豆粉(3:1)的混合粉，通过正交实验，确立的工艺条件为：酶：混合粉=1:100，T=50，PH=7.0，水解度为8%，得到的制品基本无苦味，蛋白质溶出率83.6%，钙溶率16.2%，平均粒度由8.45m减为2.61m，时间42min。3.5氨基酸螯合钙制备工艺研究氨基酸螯合钙是一类金属螯合物，是较为理想的人和动物钙补充剂。要制备氨基酸钙，就要使金属钙离子与氨基酸分子所形成的配位键稳定。氨基酸配体与金属离子的摩尔比即投料比是影响螯合反应的重要因素。由于不同的氨基酸有不同的分子量和理化性质，其结合钙离子的能力也是各不相同，所以采用各种不同方法以制备不同的氨基酸螯合钙31,32。目前国内外主要有以下几种氨基酸螯合钙的制备方法。3.5.1 液相法合成氨基酸螯合钙3.5.1.1酶解法酶解法是在蛋白原料中加入蛋白酶制剂，经过发酵制取混合氨基酸。再加入微量元素钙螯合而成。在选择钙源方面也要经过慎重的实验研究，不同的钙源与复合氨基酸反应的程度不同。要使螯合物的产率较高，应选取最适宜的配位体摩尔比和pH值、反应温度、作用时间等条件。所以应用酶法制备氨基酸螯合钙需经过反复实验研究进一步确定反应的最佳条件33,34。3.5.1.2酸解法酸解法是我国目前生产氨基酸微量元素螯合物最常用的方法。酸解法又分为三步法和二步法35,36。三步法的特点是将废弃蛋白质水解后制得复合氨基酸，然后经中和、螯合生成螯合物。工艺流程如下：氢氧化钠蛋白质水解中和螯合浓缩、干燥成品 30%盐酸 微量元素二步法是将废弃蛋白水解后，不用碱作中和剂，而以微量元素稀土元素的氧化物去除水解液中的酸，并使之螯合、中和合二为一，较三步法省去了中和工序，缩短了反应时间，减少了碱的用量，同时减少了因碱中和产生的无机盐的含量，从而提高了产品纯度。工艺流程如下：蛋白质水解中和、螯合浓缩、干燥成品。 30%盐酸 金属氧化物3.5.1.3酸碱混合水解法工艺流程如下：蛋白质酸水解混合中和过滤螯合浓缩、干燥成品。蛋白质碱水解 微量元素3.5.1.4高压流体纳米磨技术高压流体纳米磨为纳米新技术设备，其利用气穴(微米级)在外加高压(达200MPa)下压缩坍塌(微区爆裂)时所产生的高温、高压和超频声波，使液体物流中的固体微粒或液压微滴(碱性蛋白酶胰蛋白酶中性蛋白酶。由于胰酶粗提液是一种复合酶，它至少含有五种蛋白水解酶(如胰蛋白酶、羧肽酶A与B、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和激肽释放酶)、胰脂肪酶、胰淀粉酶与核糖核酸酶等。其中，胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶。这三种酶活性高，又富含激肽释放酶、弹性蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。因而它既能激活脂肪酶，又能稳定胰蛋白酶。尤其是胰酶粗提液中的蛋白酶对蛋白底物专一性较广，具有强烈的分解作用。胰酶粗提液作为混合酶效果优于单一酶。同时也可看出单一酶在水解鸡粪蛋白的效果上碱性蛋白酶最好。实验室自制胰酶粗提液的水解效果远远优于其余三者。所以我们选择胰酶粗提液做进一步研究。6.3酶解鸡粪蛋白单因素实脸根据文献报道，影响蛋白酶水解效果的因素有很多，如水解温度、pH值、水解时间、料液比、加酶量等17,49,51,54。我们设计了五组实验，分别考察碱性蛋白酶水解的最佳作用条件的范围。除了料液比单因素实验外，每组实验中我们均保持原料用量、水用量、水解液体积相同，料液比单因素实验的结果也以相同的体积基准进行了折算。所以，可直接利用氨基酸含量来表示水解程度。6.3.1pH值对水解的影响采取五个平行实验，水解时间为16h，加酶量1.5%，料液比1:7，温度40，pH分别调至7、7.5、8、8.5、9、9.5。实验结果如图3所示。图3 pH对蛋白水解度的影响Figure 3 The influence of protein hydrolysises degree by different pH由图3可看出，胰酶粗提液在pH为77.5时，水解效果相差不大，在pH7.5到8之间，水解得到的氨基酸的量大幅增加，在pH值8时氨基酸的量达到最高值，随后又逐渐下降。由此可知胰酶粗提液的最佳作用pH值在8左右。6.3.2水解时间对水解效果的影响采取五个平行实验，水解pH为8，加酶量1.5%，料液比1:7，温度40，水解时间分别为2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h。图4水解时间对水解效果的影响Figure 4 The influence of hydrolysises degree by different time如图4所示，水解时间为412h时，所得水解液中氨基酸的量呈逐渐的上升趋势，14h之后氨基酸的量上升趋势开始减少，继续水解，氨基酸的量基本不变。所以，胰酶粗提液的最佳水解时间范围在14h左右。6.3.3加酶量对水解的影响采取五个平行实验，水解pH为8，水解时间14h，料液比1:7，温度40，加酶量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。图5加酶量对蛋白质水解的影响Figure 5 The influence of protein hydrolysises degree by different enzyme quantity由图5可以看出，在加酶量为0.51.0%时，胰酶粗提液的水解效果相当，在接近2.0%时水解效果最好；当加酶量超过2.0%后，水解效果没有明显上升。可以确定，胰酶粗提液的最佳加入量为2.0%左右。6.3.4料液比范围的确定采取五个平行实验，水解pH为8，水解时间14h，加酶量2.0%，温度40，料液比分别为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9。表9不同料液比下水解液中的蛋白质水解率Table 9 The hydrolysis rate of protein hydrolysis under different solid-liquid ratio料液比1:51:61:71:81:9蛋白质水解率23%27%35%37%38%如表9所示，随着料液比的增高，蛋白质水解率增高，水解效果越好。但是，考虑到生产成本以及实际操作问题，料液比不可能无限增大。根据实验经验，本着既便于实验操作，又有利于降低成本的原则，在下一步