肿瘤学动物实验技能培训.ppt

肿瘤学动物实验技能培训,2015年7月13日,一、常用实验动物及选择品系选择,BALB/c,C57BL,裸鼠,SCID,NOD/SCID,NOG/NSG,成年动物的年龄、体重和寿命比较,一、常用实验动物及选择年龄选择,一般购买6-8周小鼠，用于实验,二、小鼠的饲养环境,微生物控制等级选择,普通级动物：示教、预实验 清洁级动物：适用大多数科研。 无特定病原体动物（SPF）：为理想的健康动物，适用于所有科研、检定。 无菌动物（GF）：适用于特殊研究。,动物室环境控制要求值,二、小鼠的饲养环境,动物饲养密度,动物饲养密度应符合卫生标准，有一定的活动面积，不能过分拥挤。 各种动物所需笼具的面积和体积因饲养目的而异，哺乳期所需面积较大，一般小鼠4-6只/笼。,二、小鼠的饲养密度,二、小鼠的饲养垫料、饲料、水,垫料、饲料均需经过辐照并密封包装。 水，自来水121度高压灭菌20min。 饲料选择营养均衡的配方饲料即可，特殊情况才选 择高蛋白，高脂肪饲料。,三、肿瘤建模,肿瘤模型类型：皮下移植瘤、肺转移模型、原位移植瘤； 查阅文献确定细胞接种浓度：一般1*106 个细胞左右； 预实验：以2倍比例选择三个细胞浓度开展预实验； 准备细胞：细胞重悬于PBS、生理盐水或基础培养基中，定量； 接种：皮下接种可选择乙醚麻醉，100 ul/位点；肺转移 尾静脉注射，用小鼠固定器，200ul/只； 对于皮下移植瘤，如需细胞数量较大，可以接种组织块儿； 皮下接种部位：Flank，背颈部，腋窝。,四、标记与分组,编号与标记方法,染色法 剪耳法 穿耳孔法 标牌法 烙印法 剪毛法,在每组动物不超过l0只或一个实验不超过40只的情况下适用 染色剂：3-5苦味酸溶液，可染成黄色,染色法：单色涂染法,四、标记及分组单色染色法,涂染原则：从左到右、从上到下 左前肢为1号、左侧腹部2号、左后肢3号， 两耳后部4号、背部5号、后肢背部6号， 右前肢7号、右侧腹部 8号、右后肢9号 头部为40号、尾巴根为10号。,方法步骤,四、标记及分组单色染色法,在每组动物不超过100只的情况下适用 常用染色剂：3-5苦味酸溶液，可染成黄色，作为“个”位数 常用染色剂：0.5%中性红或品红溶液，可染成红色，作为“十”位数,四、标记及分组双色染色法,用两种颜色同时进行染色标记 用苦味酸(黄色)染色标记作为个位数，个位数的染色标记方法同单色涂染法 用品红(红色)染色标记作为十位数,四、标记及分组双色染色法,方法步骤,左前肢为10号、 左侧腹部20号、左后肢30号 两耳后部40号、 背部50号、 后肢背部60号 右前肢70号、右侧腹部 80号、右后肢90号 第100号不作染色标记,方法步骤,穿耳孔法：用专用耳空器在动物耳朵不同部位打一小孔或缺口表示一定号码的方法。原则是：左耳代表十位，右耳代表个位。 标牌法：一般挂在动物的颈部、耳朵、脚上。 烙印法 剪毛法,四、标记及分组其他方法,四、标记及分组分组,一致性原则 差异是绝对的，一致是相对的 利用随机数字表进行随机分组，最大限度避免人为因素,五、治疗、给药,治疗起点和途经根据不同的肿瘤和治疗药物不同而定； 皮下移植瘤，尾静脉给药：50 mm3,100 mm3； 皮下移植瘤，瘤内给药：200-300 mm3； 腹腔给药。,六、肿瘤的测量,皮下移植瘤：游标卡尺测量，称重，小动物活体成像； 肺转移瘤：肺表面结节数，小动物活体成像；,皮下移植瘤实验：生存期较长，有如下情况者处死小鼠， 记为死亡： 肿瘤长径达到2cm，或体积大于1cm3； 蜷缩不动； 毛发蓬松脏乱无光； 对外界刺激无反应； 体重明显下降的（24h内下降2-3g）。,七、小鼠生存期统计治疗终点,转移瘤实验：一般生存期较短；,八、动物组织标本采集,收集心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，福尔马林固定， HE染色观察治疗毒性；,治疗实验：,收集肿瘤组织，福尔马林固定，观察肿瘤指标；,免疫荧光实验：收集新鲜组织，做冰冻切片；,九、动物实验伦理,悉心照料动物，保证正常生存条件； 皮下移植瘤体积最大长至长径2cm或体积1cm3； 实验结