用高内涵筛选技术从马齿苋中筛选抗糖尿病有效成分及产品开发可行性研究报告.doc

南昌市科技项目可行性研究报告计划类别： 科研攻关类计划项目类别： 社会发展重点攻关项目课题名称：用高内涵筛选技术从马齿苋中筛选抗糖尿病有效成分及产品开发申请单位： 江西科技师范学院 （盖章）项目（课题）负责人： 李玉萍起止年限： 2007.01-2009.12通讯地址、邮编： 南昌市昌北开发区（330013）联系电话、传真：告编制单位： 江西科技师范学院二六年十月 用高内涵筛选技术从马齿苋中筛选抗糖尿病有效成分及产品开发项目可行性研究报告一、总论（一）项目的主要内容及技术原理简述1、马齿苋的预处理及成分的分离,提取：粗提取液再经制备式高效液相色谱仪（HPLC）分离、自动回收仪回收样品；2、体外胰岛细胞培养及干预方法的建立：包括胰岛细胞维持、糖尿病胰岛细胞模型的诱导、处理浓度及时间的确定等；3、被筛成分抗糖尿病效价检测及作用机理探讨： 用倒置显微镜观测、WST-8还原法和ELISA检测胰岛细胞的形态、生长、分化、迁移；用 DNA ladder analysis和TUNEL assay检测细胞凋亡；代谢途径及用Western-blotting和RT-PCR法解析信号转导等指标；4、模型动物的糖尿病症状改善的评价：糖尿病模型的诱导、被筛选有效成分处理、血糖、胰岛素等特征性指标检测。（二）项目的目的和意义目的：本项目将利用高内涵筛选技术，以胰岛细胞为研究对象，通过检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，确定其生物活性和潜在毒性，获得被筛样品对胰岛细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。从细胞或分子生物学水平上进行多靶点,多层次筛选出具有保护胰岛细胞受损、促进胰岛素分泌功能和调控胰岛素信号的安全有效的抗糖尿病天然有效成分，为开发抗糖尿病新药或功能食品提供安全有效的原材料。意义：本研究结果不仅有助于进一步认识糖尿病的发病机制，为防治糖尿病提供理论依据，而且可通过本高内涵筛选技术平台的建立，从细胞分子水平快速筛选马齿苋中具有防治糖尿病的有效成分，阐明这些天然活性成分作用的物质基础,为开发具有我国或我省自主知识产权的创新药物或功能性食品奠定基础。对推动江西省药食两用植物的现代化研究和开发工作走上一个新台阶，对促进江西的经济发展都具有十分重要的意义。（三）相关技术领域国内外发展现状、趋势化合物活性成分筛选是创新药物研究的起点和具有决定意义的步骤。近十年来兴起了以化学、基因组研究、生物信息、以及自动化仪器等先进技术方法有机结合的高通量/高内涵药物筛选技术，通过对种类繁多的合成及天然化合物作针对各种药物靶体的筛选，从中寻找最佳的先导化合物，进而用于新型药物的开发。具有规模大、速度快、成本相对较低、缩短新药开发周期等特点，已经被世界各大医药公司广泛用于药物先导物的筛选，成为目前制药领域研究的重要课题。同时，随着人们对健康的意识加强，世界各国对发展功能性食品非常重视, 利用先进的生物技术和高通量/高内涵筛选技术来分类、提取、纯化、筛选食物中功能性成分, 以便发现对糖尿病具有治疗效果的天然药物和辅助疗效的功能性食品，并把功能性食品作为21世纪食品发展方向和食品工业的主导产品。（四）项目申请单位、主要合作申请单位及项目主要负责人的基本情况1、项目申请单位：江西科技师范学院(南昌科技大学(筹)生命科学学院硬件建设总投资1000万元，设有食品科学和生物工程两个研究室。拥有结构完整、设备先进的以细胞和分子生物学研究为主体，与食品科学和医用高分子材料有机结合的生物工程技术实验室，基本具备本项目研究所需的仪器设备和专业实验场所（包括1个千级细胞培养室），在生命科学与疾病的基础研究领域处于国内外先进水平。在师资队伍、图情资料、教学设备、科研项目等方面已有相当的基础，具备承担本项目的条件。2、合作单位-江西省劳动卫生职业病研究所可以为本项目提供动物药理学评价的动物、场地及设备3、项目主要负责人：项目负责人之一李玉萍博士/教授，毕业于日本国立九州大学生物资源和生物环境研究院遗传资源工学细胞工程专业。曾在日本国立医药品食品卫生研究所医疗用品部做博士后研究员，进行关于“利用干细胞等构建细胞组织医疗器官的开发及评价技术的标准化”的研究。在日本留学和工作期间，一直从事功能性食品和医药品的基础研究和开发及安全性评价，在药品和功能性食品的开发研究工作中积累了丰富的经验，尤其是与糖尿病相关研究方面具有较强的理论基础和熟练的操作技能。已发表SCI和ISTP等国际权威学术索引收录和检索相关论文17篇。项目负责人之一刘志勇副研究员，曾参与国家”1035”计划槐定碱抗癌药理药化研究；主持江西省卫生厅青年希望计划一项,已结题并通过省级成果鉴定；主持江西省自然科学基金一项,已结题并通过省级成果鉴定；主持江西省卫生厅重点招标项目一项,即将结题。参与高纯度尿卵泡刺激素的纯化和生产工艺研究,2003年9月通过省级科技成果鉴定。获南昌市2003年科技成果一等奖；2004年获南昌市年科技成果二等奖；2005年获南昌市年科技成果二等奖。已发表论文15篇。（五）有关本项目的现有工作基础和支撑条件工作基础：本研究具有较好的前期工作基础和经验积累。本项目主持人多年从事利用天然产物研发防治糖尿病功能性食品及其作用机制的研究工作，曾主持和参与完成了多项日本国部级课题和横向课题,如: 1. 日本厚生省(卫生部)人类科学综合研究基金课题(2004.4-2007.3)“利用干细胞等开发细胞组织医疗器官及评价技术的标准化的研究”；2. 日本文部省（教育部）学术振兴会(2001.4-2004.3) “机能水抗糖尿病的研究”,； 3. 日本宫崎野口研究所(2002.10-2004.3)“21世纪抗糖尿病饮料(Catalyser21TM)的功能性评价及防病机理探讨”； 4. 日本日田水株式会社(2001.4-2004.3) “天然活性水抗糖尿病作用机理的探讨”。 已成功掌握了胰岛细胞筛选模型建立、糖尿病动物模型的建立、以及实验中将要运用得细胞分子生物学技术等系统研究方法，掌握了本项目中需要的研究方法和技术。同时，本项目组主要成员均为相关专业的博士和硕士学位获得者或硕士在读者，熟悉现代细胞分子生物学理论和生物技术方法，均参与过省部级和校级课题,具有良好研究基础和研究积累，在化合物的合成及其生物学应用、植物的转基因和愈伤组织培养方面也取得良好的科研成果，已发表相关SCI或ISTP或核心期刊论文数十篇。因此，本项目研究具有很强的可行性和较高的成功率。支撑条件：江西科技师范学院(南昌科技大学(筹)生命科学学院硬件建设总投资1000万元，设有食品科学和生物工程两个研究室。拥有结构完整、设备先进的以细胞和分子生物学研究为主体，与食品科学和医用高分子材料有机结合的生物工程技术实验室，具备本研究所需的全部仪器设备和专业实验场所，主要包括：核酸电泳系统(BIO-RAD) 、蛋白电泳系统(BIO-RAD) 、 倒置显微镜(Nikon) 、高速冷冻离心机(Heraeus) 、 梯度PCR（Eppendorf）、高效液相色谱系统（Agilent 1100）、 高效气相色谱系统（Agilent）、荧光定量PCR(BIO-RAD) 、凝胶成相系统（Syngene）、生物芯片研制系统(Cartesian Technologes Series) 、自动纯水与超纯水系统（Millipore）、生物安全柜（Forma）、全自动高压灭菌锅、紫外分光光度计、酶标仪、高温烘箱、真空印迹系统、蛋白分离纯化系统、超低温冰箱、CO2培养箱、杂交炉、冷冻干燥加离心浓缩系统、超声细胞破碎仪、全温度恒温培养振荡器、真空干燥箱、 台式恒温水浴振荡器、超净工作台等一批先进的大型科研仪器设备，具备顺利完成本项目所需要的仪器设备。江西省劳动卫生职业病防治研究所医学实验动物中心，有实验用房1300平方米，包括常规毒理实验室、屏障系统实验动物房、开放系统实验动物房、病理实验室、细胞遗传实验室、毒物化学分析室、生化实验室、免疫实验室、微生物实验室等。取得全国统一的实验动物使用许可证(证号：SYXK(赣)2003-0003)和卫生部化学品毒性鉴定乙级资质(证号：卫毒鉴准字(2003)第B-06号)。已成功建立的动物模型包括：钩端螺旋体病动物模型、迟发性神经毒动物模型、高脂血症动物模型、糖尿病动物模型，肿瘤药物的筛选模型、抗辐射作用动物模型等。具备完成本项目所需条件。通过国内国外的网络资源，本项目所需的资料查新工作已基本完成，并获得了目前相关研究的最新资料。二、项目实施方案（一）项目达到的目标及考核的主要技术经济指标（含知识产权、技术标准）1、筛选出有效成分：保护胰岛细胞破坏和/或促进生长、维持胰岛细胞分泌功能；改善糖尿病及其并发症的症状2、通过机理探讨，发现有效成分作用的物质基础，获得开发新产品的相关生物信息；3、综合实验结果，选择最安全有效的天然有效成分，开发防治糖尿病的新药或功能食品。（二）项目的主要研究（开发）内容1、马齿苋的预处理及成分的分离,提取；2、体外胰岛细胞培养及干预方法的建立；3、被筛成分抗糖尿病效价检测及作用机理探讨；4、糖尿病模型的药效评价；5、确定安全有效、多重功效的有效成分；6、开发安全有效的防治糖尿病新产品。（三）试验（开发）规模及地点试验研究地点在江西科技师范学院及江西省劳动卫生职业病防治研究所。（四）主要技术关键及创新点技术关键：1、天然有效成分的分离、提取和提纯（HPLC）条件； 2、体外胰岛细胞培养及干预方法的建立；3、Western blotting analysis和RT-PCR技术；4、建立快速筛选防治糖尿病有效成分的筛选体系。创新点：1、糖尿病及其慢性并发症是一多因素参与的，累及多系统的病理过程,由于目前西药作用较为单一，因此在如何有效阻止/延缓糖尿病及其慢性并发症的研究中显得较为局限。采用细胞筛选模型，可以从细胞的形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等多层次、多角度的筛选具有多方面药理效果的药物成分，开发新型药物或功能性食品，在预防或阻止/延缓糖尿病及其慢性并发症的研究中具有较大的优势; 2、目前高通量糖尿病药物筛选的研究大多停留在单一体外筛选模型的建立、整体动物实验观测水平，以改善糖尿病及其慢性并发症的单一病因为研究目的，本课题的研究在建立细胞筛选模型的基础上结合整体动物实验以及组织病理学检测，较为系统地对被筛选药物成分在阻止/延缓糖尿病及其慢性并发症中的作用及分子机制进行研究，至今尚未见类似的研究报道；3、高通量/高内涵筛选技术在糖尿病研究领域的研究应用尚属起步阶段，本课题的设计有助于我省改善目前天然产物基础研究落后、技术含量低的局面，加快防治糖尿病药效成分的筛选，为传统中药现代化和功能性食品的开发提供实验依据；4、目前我省尚未建立食物高内涵筛选技术平台，本研究成果将首次在省内搭建快速筛选防治糖尿病有效成分的平台，为充分利用资源丰富的地域或特色资源，为开发具有自主知识产权的创新药物和功能性食品奠定理论基础。（五）实施方案（含技术路线、工艺流程及技术关键的解决方案）（六）技术风险分析本项目所要应用的细胞培养、动物饲养和药效评价方法及检测技术等都是成熟的技术。本项目主要成员均承担过省部级,校级课题,具有良好研究基础和经验积累.（七）分年度的工作内容、目标2007.1-2007.12马齿苋的预处理、成分分离、提取、纯化、优化条件等2008.1-2008.12细胞模型的诱导、高内涵筛选技术的应用、确定最佳处理浓度和反应时间、探讨有效成分作用的新靶体等2009.1-2009.12动物模型效果验证、确定最佳的有效成分、整理实验结果，分析数据，编写项目总结报告和论文发表，成果鉴定、产品开发等 （八）申请单位、合作申请单位及主要人员的分工姓 名职务职称所在单位在课题中的分工李玉萍教授/博士江西师范科技学院项目主持/设计刘志勇副研究员/在读硕士江西省职防所动物试验设计王德解助教/硕士江西师范科技学院分子生物学检测周春丽助教/硕士江西师范科技学院细胞培育苏 虎助教/硕士江西师范科技学院细胞生物化学检测周银平主任/研究员/在读硕士江西省职防所动物生化指标测定谢国秀实习研究员/硕士江西省职防所动物饲养、常规观测杨新跃副所长/研究员/在读硕士江西省职防所统计分析（九）组织及管理的运行机制本项目由江西科技师范学院生命科学学院承担，江西省劳动卫生职业病防治研究所协作完成。（十）相关依托工程（含技术）的落实情况江西科技师范学院生命科学学院和江西省劳动卫生职业病防治研究所具备本项目所需的试验技术。（十一）有关本项目的国内外知识产权状况分析高通量药物筛选（HTS）工作在我国的研究应用起步较晚，在1996年和1998年中国医学科学院分别引进国内第一台Bionek2000型实验自动化工作站和Topcount微量闪烁计数器，使放射配基实验，发射免疫实验等技术微量化和自动化。1998-2003年，我国实施了首批“973”项目-重要疾病创新药物先导化合物结构的发现和优化的研究工作。虽然HTS技术的研究应用已取得了长足的发展，并初见成效，但尚不规范，存在急需解决的许多难题。为了有效地解决上述问题，近年来发展起来的新的筛选模式-高内涵筛选（high-content screening, HCS）。HCS是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，尽可能同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡及信号转导等多个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定被测样品的多重生物活性。HCS已经引起国际大制药公司的高度重视，全球已有约60家新药研究机构启动了这一领域的研究项目。 从我们的查新结果可知，利用高通量/高内涵筛选技术进行马齿苋（药食两用植物）中筛选抗糖尿病有效成分并开发成药物或功能性食品，属国内外领先水平。三、市场分析（一）市场预测（含同类项目的国内外市场情况）据世界卫生组织统计,目前全球有3亿人患有糖尿病(包括隐性糖尿病人群),其中中国糖尿病患者近6000万人。据世界卫生组织对糖尿病发病现状与发展趋势的最新预测,21世纪2型糖尿病将在中国、印度等发展中国家流行,到2025年,我国II型糖尿病患者总数接近1亿。目前，还没有药物能从根本上治疗糖尿病。相反,长期使用药物所致的依赖性,严重的毒副作用加重了对胰岛功能的损害。因此，对安全有效的天然药物的研究和开发需求非常迫切，有着广阔的需求市场。此外，功能食品市场发展迅猛，专家预测，未来十年内，全球功能食品的市场份额每年将以10的速度增长，远超过其他食品和饮料年均2的增长速度。在美国大约有50的消费者为了健康目的而购买功能食品，以降低心血管病、癌症、肥胖和糖尿病等慢性病风险。据统计2000年我国保健功能性食品市场年销售额达到500亿元，权威部门预计随着经济的发展，人民生活水平的提高，糖尿病的发病率随之增加，2010年将达到1000亿元，市场需求将会逐年提高。（二）本项目的市场竞争优势、风险及市场策略江西省是个农业大省和全国有名的药材产地，拥有丰富的具有防治糖尿病功能的食物和药食两用植物资源，其中药食两用植物马齿苋（Portulaca oleracea L.）尤为常见，含有人体所需的18种氨基酸、多种维生素（维生素E、维生素C、-胡萝卜素等）、高浓度的去甲肾上腺素、-3脂肪酸、多糖、黄酮、生物碱、丰富的矿物元素等多种营养和药用成分。实施本项目，可利用HTS/HCS技术从马齿苋所含多种成分中筛选出一个或多个安全、多重疗效的有效成分，作为开发新药品或功能性食品的原料，将产生巨大的经济效益和社会效益。同时，从细胞分子水平阐明其作用机理，改善中药现代化研究工作中基础研究缺乏及技术含量低的现状，提高传统中药在国际市场上的知名度和竞争力度，促进江西的经济发展。（三）经济社会效益分析从经济指标来讲，糖尿病是一种与生活习惯密切相关的终身疾病，其高发病率，多并发症和高致残率给社会及其个人带来沉重的经济负担。利用来源广泛、价格低廉的马齿苋有效成分开发而成的安全、多重药效的新产品，不但能维持血糖的稳定，而且能阻止/延缓糖尿病慢性并发症的发生，长期使用必将大大减轻社会及其个人的经济负担；同时，可为天然产物的新用途的开发提供理论依据和建立一个快速筛选平台，进一步充分利用和开发我国丰富的天然资源, 促进经济发展。尤其是通过对江西省出产的天然资源的比较筛选和功能检测,开发具有自主知识产权的创新药物和产品,必将促进江西经济的快速持续发展。从社会效益来讲，服用从马齿苋中筛选出的天然有效成分做成的各种剂型的药物或食品添加剂，可以使亚健康人群和糖尿病及其慢性并发症患者得到预防和治疗，重返社会并参加力所能及的工作，提高糖尿病及其慢性并发症患者的生活质量，必将产生积极的社会效应。并且，通过多学科交叉及多HCS研究方法的应用，对有效成分防治糖尿病的分子机制的探讨，为临床应用提供理论基础，也为今后的开发研究和国际间的协作研究奠定基础。（四）推广应用及产业化分析我们已计划在江西省内建立一个防治慢性疾病（如癌症、心脑血管疾病、糖尿病、肥胖等）有效成分快速筛选平台和申报功能性食品检测基地，面向国内外推广项目成果。四、经费预算及筹措方案（一）经费预算（总投资）本项目经费预算经费为12万元。（二）新增投资1、固定资产1.5万元2、流动资金10.5万元（三）筹措方案及相关证明江西科技师范学院生命科学学院本着“高位启动、高速发展”的原则成立于2004年。学校非常重视生命科学学院的发展，已经硬件投入了上千万的经费。为鼓励教师从事科研工作，学校制定了为申请到科技项目基金的教师额外再配备50%的配套资金的政策进行支持。因此，本项目如获得8万元的科技三项经费即可同期到位4万元的学校配套资金。（四）申请经费的主要用途 名 称金额（万元）时 间开发及实验费查新费0.22007.1-2009.12调研费0.82007.1-2009.12原材料购买及成分分离、提取、检测费1.52007.1-2008.12有效成分筛选试验费4.02007.1-2009.12细胞培养和动物饲养费1.02007.1-2009.12项目管理费、技术咨询费0.52007.1-2009.12动力费及其它0.52007.1-2009.12项目鉴定费、成果推广费2.02009.1-2009.12设备费自动回收器0.52007.1-2007.12色谱柱1.02007.1-2007.12