蛋白质化学课件

第 四 章,蛋 白 质 化 学,在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的70%以上，种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作用。,蛋白质元素组成(按干重计算),在任何生物样品中，每克氮的存在，大约表示该样品含100/16=6.25g蛋白质。凯氏定氮法以生物样品中的含氮量计算 蛋白质含量（质量分数，）每克样品中氮含量g 6.25 100%,主要元素： C、O 、N、H 、 微量元素：S、P、Fe、Zn、Cu、Mo、I ,1克氮相当于6.25克蛋白质为测定样品中蛋白质含量的依据,生命信息的流动分为两个部分 : 第一部分 遗传信息通过转录和翻译传入蛋白质 的一级序列氨基酸序列中 , 这是一 维信息之间的传递 , 第二部分 是肽链折叠形成特定复杂的空间结构的 同时获得生物活性 , 从而将生命信息表 达出来 ; 这种转化过程是表现生命活力所必需的。,测定蛋白质结构的主要方法 ： X 射线晶体法： 蛋白质晶体 多维核磁共振技术：测定蛋白质的溶液结构 , 但 仅适用于小蛋白 . 理论计算蛋白质结构预测方法势在必行 ， 所以了解蛋白质结构层次和规律十分必要。,引言 蛋白质结构的测定,您知道“蛋白质折叠病”吗？,“折叠病”: 疯牛病、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等等。 相关蛋白质的空间结构异常。 是致病蛋白质分子通过分子间作用感染 正常蛋白质而造成的。 请注意：致病蛋白质分子与正常蛋白质分子的构成完全相同，只是空间结构不同。,氨基酸： 是组成蛋白质的基本单位， 是蛋白质水解的最终产物。 指含有氨基的羧酸， 生物体内的各种蛋白质者是由20种基本氨基酸构成的。 除脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点。,一、蛋白质结构的基本单位,氨基酸的结构,构成蛋白质的20种氨基酸,L-构型与D-构型,-氨基酸有两种构型:D构型和L构型 它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。 凡是与L甘油醛（或L乳酸）构型相同: 就定义为L氨基酸， 反之为D氨基酸。,20种氨基酸的侧链结构及极性迥然不同,氨基酸分类,按R基和氨基酸性质的不同可分为 脂肪族氨基酸 芳香族氨基酸 碱性氨基酸 含羟基或含硫氨基酸 环氨基酸以及酸性氨基酸及其酰胺,此类氨基酸由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸六个或称为疏水性氨基酸 此类氨基酸在水溶液中溶解度小。,氨基酸分类,（一）侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸,(二)侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸,此类氨基酸有甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺； 半胱氨酸侧链的巯基失去质子的倾向较此类其他氨基酸为大，其极性最强。,氨基酸分类,（三）侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸,此类氨基酸有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 其侧链分别由苯基、酚基和吲哚基； 苯基的疏水较强；酚基和吲哚基在一定的条件下可解离。,氨基酸分类,（四）侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸,此类氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸； 其侧链都含有羧基，均可解离而带负电荷；,氨基酸分类,（五）侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸,此类氨基酸有赖氨酸、精氨酸和组氨酸； 其侧链分别含有氨基、胍基、和咪唑基，均可发生质子化，使之带正电荷。,氨基酸分类,侧链R基分类后排布,按营养状况分,必需氨基酸 ：人和动物体内需要而又不能自身合成，必须由食物供应的氨基酸。,半必需氨基酸 ：尽管自身可以合成，但合成量不能满足需要，尤其是婴幼儿，不能自身合成的氨基酸。,非必需氨基酸 ：其他可已在体内合成以满足需要的氨基酸。,氨基酸分类,营养学分类,必需氨基酸：在某些生物体内不能合成或合成量不足以维持正常生长发育，必须依赖食物供给。 人体所需的八种必需氨基酸： 赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Try) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 苏氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe) 婴儿时期所需: 精氨酸(Arg)、组氨酸(His) 早产儿所需： 色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys) 非必需氨基酸：由机体自行合成的氨基酸。,脯氨酸-含有环状二级氨基 （亚氨基酸）,特殊氨基酸,Cystine (胱氨酸) is dimer of cycteine (半胱氨酸),特殊氨基酸,被修饰氨基酸,蛋白质合成过程中通过修饰加工，改变其侧链的化学结构生成的一些氨基酸。没有相应编码，具有新的结构和功能。,胶原中出现的羟基氨基酸残基是形成坚韧的胶原纤维 的必要条件；,（Hyp）,（Hyl）,四碘甲腺原氨酸（T4）,甲状腺球蛋白中带有甲状腺素等碘化酪氨酸残基。,非蛋白氨基酸： 蛋白质中不存在的氨基酸：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。,鸟氨酸,瓜氨酸,非蛋白氨基酸,自然界中还存在一些并不是蛋白质组分的非蛋白氨基酸，已经发现有200余种，具有不同的功能; 细菌中含有多种-氨基酸：细菌细胞壁丙氨酸、短杆菌肽D和多粘菌肽中D-亮氨酸,二、肽键与肽的概念,氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基失水形成特殊的酰胺键称为肽键，形成的化合物称为肽。,肽的结构,氨基未端（N-未端）,羧基未端（C未端）,肽单位（肽平面）：6个原子处于同一平面构成。 在大多数情况下：羰基氧原子、酰胺氢原子 以反式结构存在。,肽平面是肽链盘曲折叠的基本单位,肽键的特点：,部分双键性质，不能自由旋转。 由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部 分双键的性质，不能自由旋转。,肽的命名： 从左到右 某氨酰-某氨酰-某氨酸。 如：Gln-Cys-Gly 一般由几个AA组成的肽称为几肽。 寡肽: 12个氨基酸以下的短肽 。 多肽: 十个氨基酸形成的肽 。 多肽与寡肽之间无严格界限。,多肽是一个线性链状分子,肽链中的氨基酸不是原来完整的分子，多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。,肽键,链状结构,天然存在的重要多肽,谷胱甘肽(glutathione, GSH)是体内重要的还原肽,谷胱甘肽的分子中有一个特殊的肽键，是由谷氨酸的羧基与半胱氨酸的氨基缩合而成。由于GSH中含有一个活泼的巯基很容易氧化，二分子GSH脱氢以二硫键相连成氧化型的谷胱甘肽（GSSG）。,重要的天然寡肽,含有活泼的巯基，易氧化。氧化型和还原型可以互变.,广泛分布于生物体内，有许多重要生理功能； 是某些氧化还原酶的辅酶，对巯基酶的(SH基)有保护作用，具有防止过氧化物累积的功能。 在临床上用作治疗眼角膜疾病；解除丙烯酯、氟化物、重金属、一氧化碳、有机溶剂等中毒症状的解毒药物； 运动营养食品和功能食品添加剂等。 被称为长寿因子和抗衰老因子,谷胱甘肽（GSH）,激素,促甲状腺素释放激素（TRH）：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯氨酸），可促进甲状腺素的释放。,促甲状腺素释放激素的N端残基是谷氨酸，此残基易于自身环化成焦谷氨酰基（氨基与谷氨酸的羧基脱水缩和而成）。,抗生素,抗革兰阴性杆菌抗生素， 具杀菌作用,具有表面活性剂的作用,能降低细菌细胞膜的表面张力,改变膜的通透性,甚至破坏膜,生物活性肽 ：21世纪人类健康的宠儿,营养学研究：摄食蛋白质，大多是以低肽形式消化吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。 进一步试验：肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，表明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。 活性肽具有多种代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。,问题1 解释肽键的双键性？,第三节 蛋白质分子构象与结构层次,一级结构 氨基酸顺序 二级结构 螺旋、折叠、转角、无规卷曲 三级结构 螺旋、折叠、转角、松散肽段 四级结构 多亚基聚集,介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构实体）的两个层次。,构象：蛋白质特有天然空间结构,蛋白质分子结构总结,一级结构 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 亚基 四级结构,维持蛋白质构象的作用力,构象的稳定性主要靠一系列弱作用力维持，包括： 氢键、范德华力、疏水作用、 盐键、二硫键、配位键等。 疏水键：水溶液中，分子的非极性基团间缔合作用。 在生物大分子中的疏水部分相互缔合形 成分子的疏水区域。,维持蛋白质分子构象的化学键,二、蛋白质的二级结构,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。,定义：,稳定因素： 氢键,二面角,肽平面1 单键旋转，旋转角度“”表示 肽平面2 单键旋转，旋转角度“”表示,二面角：00+1800范围内变动，多肽链可以形成各 种各样的 折迭方式。 决定多肽链主链骨架的构象。,肽平面1,肽平面2,C2,N1,二面角 (dihedral angle):,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（一） -螺旋,结构要点: 多肽链主链围绕中心轴形成 右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。 每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。 每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。,肌红蛋白、血红蛋白 的许多肽链段落呈螺旋 结构。 毛发中的角蛋白，肌肉 中的肌球蛋白，血凝块中的 纤维蛋白，他们的多肽链 几乎全都卷曲成螺旋。,（二）-折叠, 肽链充分伸展，折叠成锯齿 状结构，侧链位于锯齿结构上下方。 两段以上的 -折叠结构平行排列 ，两链间可顺向平行，也可反向平行 。 两链间的肽键之间形成氢键，以稳固 -折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。,两链间的肽键之间形成氢键,顺向平行 , 两残基间距为 0.65nm,反向平行 , 两残基间距为 0.70nm 反式折叠较顺式折叠更加稳定,（三）-转角和无规卷曲,-转角：, 肽链内形成180回折。 弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。 第2、3氨基酸残基常为Pro或Gly,-转角的类型,转角的 回折或发夹结构，广泛存在球状蛋白质中的一种结构。,无规则卷曲( random coil ),指没有一定规律的松散肽链，但仍是紧密有序的稳定结构。 通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象 球蛋白分子中，往往含有较多的无规卷曲。 E的功能部位常处于此种构象中。 无规卷曲与生物活性有密切关系。对外界理化因子极为敏感,各类氨基酸与蛋白质二级结构关系,（四）模体（超二级结构）,蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体(motif)。, ,超二级结构,目前发现的超二级结 构有三种基本形式 : 螺旋组合 () 折叠组合 () 螺旋和折叠组合 ( ) -最常见组合,超二级结构的形成 ： 侧链基团相互作用。,螺旋环螺旋 helix-turn-helix,锌指 zinc finger,helix-loop-helix,钙结合蛋白分子中通常有一个结合钙离子的模体, 环内有几个恒定的亲水侧链，侧链末端的氧原子 可以结合钙离子。,Ca2+,zinc finger domains,N端 1对半胱氨酸 C端 1对组氨酸,N端,C端,leucine zipper,（五）影响二级结构形成的因素,氨基酸侧链所带电荷 、大小及形状。,影响-螺旋形成的因素：, -折叠形成条件： 要求氨基酸侧链较小。,问题2、总结不利于螺旋的生成的因素？,酸性或碱性氨基酸连续存在于多肽链中, 由于所带电荷而同性相斥 , 阻止链内氢键形成趋势而不利于螺旋的生成 ; 较大的氨基酸残基的 R 侧链 ( 如异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等 ) 集中的区域 , 因空间阻碍的影响 , 也不利于螺旋的生成 ; 脯氨酸或羟脯氨酸残基的存在 则不能形成螺旋 , 因其 N 原子位于吡咯环中 , C-N 单键不能旋转 , 加之其亚氨基在形成肽键后 ,N 原子上无氢原子 , 不能生成维持螺旋所需之氢键。,结构域（structural domain）,相邻超二级结构间紧密联系,进一步折叠形成 一个或多个相对独立的致密的特定区域，,结构域（structural domain）,结构域通常是几个超二级结构的组合； 结构域一般由100200 个氨基酸残基组成，但范围可达 40400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上, 在结构域可作为结构单位进行相对独立运动， 使蛋白质分子实现一定的生物功能。 从蛋白质分子内水解出来的结构域若能维持结构稳定，则可以保留某些生物活性。,结构域与分子整体以共价键相连 , 一般难以分离 , 这是它与蛋白质亚基结构的区别。,如： 免疫球蛋白 (IgG) 由 12 个结构域组成 ： 两个轻链 （低分子量）上各有 2 个结构域, 两个重链（高分子量）上各有 4 个结构域。 一般说来： 对于较小蛋白质分子，结构域与三级结构等同， 即这些蛋白为单结构域。 较大蛋白质为多结构域 , 它们可能是相似的 , 也可能是完全不同 的。,Protein domains,The cell-surface protein CD4 consists of four similar domains.,三、蛋白质的三级结构,疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力 及二硫键。,稳定因素：,是一条多肽链的完整的构象，包括全部的主链和侧链的专一性的空间排布。 即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定义,（1）、在一级结构的顺序排列上相距甚远的氨基酸残基可能在特定区域内彼此靠近。 疏水区： 烷基、苯基内拉形成疏水核心； 亲水区：羟基、羧基、氨基、胍基形成亲水表面 （2）蛋白质分子表面往往有明显的凹陷或裂隙，其中以特定方式排布的某些极性氨基酸残基参与和决定着该蛋白质的生理活性。,蛋白质的三级结构特点,磷酸丙糖异构酶 和 丙酮酸激酶 三级结构,溶菌酶分子的三级结构,肌红蛋白(myoglobin),由153个AA残基组成的一条多肽链及一个血红素基团， M=17600 大小：453525。,80的氨基酸残基处在-螺旋区域，分子中没有折叠层，在肽链的拐曲处呈无规则卷曲。 几乎所有的疏水残基均位于分子内部，大部分极性基团暴露于分子表面。,血红素垂直伸入螺旋E和螺旋F之间的疏水口袋中，铁原子与肽链中HiS92通过配位键络合。,亚基之间的结合力 氢键 离子键,四、蛋白质的四级结构,蛋白质四级结构 分子中各亚基的空间排布和 相互作用。,亚基（subunit）参与构成蛋白质四级结构的、 具有三级结构的多肽链。,亚基的立体排布方式,注： （1）亚基单独存在时没有生物活性。 （2）亚基都是具有三级结构的多肽链，反之不一定。 如肌红蛋白是一条具有三级结构的多肽链。 （3）一条肽链不涉及到四级结构。,单体蛋白：指由一条多肽链组成的蛋白质。 寡聚蛋白：指由两条或更多的具备独立的三级结构的多肽链以次级键相互谛合而成的聚集体。,四级结构的典型构象血红蛋白,球状蛋白，寡聚蛋白，含4个亚基：22 链：141个残基； 链：146个残基 分子量 65 000,每个亚基均有与肌红蛋白相似的三级结构。 但单独存在时不具生理活性，只有这四个亚基组成的四聚体（具有了四级结构）才有生理活性。,四条多肽链，1122 各含一个血红素，各结合一分子氧。 亚基间8个离子键连接。,血红蛋白,2,2,分子伴侣 (chaperon),通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质。,* 可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可使肽链正确折叠。,* 与错误聚集的肽段结合，诱导其正确折叠。,* 对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要的作用。,作用：,纤维状蛋白质的构象,（1）角蛋白（keratin）,-角蛋白,（2）丝心蛋白（也称丝蛋白，fibroin）,（3）胶原蛋白（collagen）,第四节 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,2. 多肽类激素及神经肽,1. 一级结构不同，生物功能各异：,一、蛋白质一级结构与功能的关系,如： ACTH（促肾上腺皮质激素）、 -MSH （促黑激素） 和 -MSH 共有一段相同序列， ACTH也有较弱的促黑作用。,一级结构中的“关键”部分相同，其功能也相同,促肾上腺皮质激素（ACTH）: 39肽， 1-24肽段是活性所必需的关键部位 去除25-39肽段仍保持生物活性。 实验表明：不同动物来源的ACTH， 1-24肽段氨基 酸顺序相同，生物功能相同。,蛋白质或多肽的生物功能并不要求分子的完整性,2 、一级结构是空间构象的基础,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态、无活性,牛核糖核酸酶的一级结构,例2：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,问题： 从结构角度分析镰刀红细胞贫血的原因 ？,肌红蛋白与血红蛋白的结构,二、蛋白质空间结构与功能的关系,结合平衡常数 K1K2=K3K4,Hb与Mb都能可逆地与O2结合,肌红蛋白与血红蛋白的氧结合曲线,氧饱和度,氧分压,肌红蛋白 是一条双曲线 血红蛋白 是一条S型曲线,* 协同效应(cooperativity),寡聚蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 促进作用称为正协同效应 (positive cooperativity) 抑制作用称为负协同效应 (negative cooperativity),变构效应(allosteric effect),凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应。,O2,F8 Histidine,空间排斥,EF,FG,1个亚基中血红素铁与氧结合后构象改变， 致另3个亚基间次级键破 坏引起构象改变， 整个分子构象变化，使其变得宜于与氧结合， 所以加快了血红蛋白与氧结合的速度。,血红蛋白的构象变化与结合氧,1,2,4,3,肌红蛋白与血红蛋白 结构不同生物功能不同,肌红蛋白 储氧功能，只有当剧烈活动时血液输氧不足以补偿肌肉消耗而致局部氧分压很低的情况下，才放出氧来应急。 血红蛋白 运输氧功能，它既能在肺筛泡的高氧分压条件下充分结合氧，又能在周围组织的低氧分压条件下将大部分氧释放出来。,肌红蛋白和血红蛋白对氧亲和性的差异有效的转运系统 它们的生理作用与其在低氧压下对氧的相对亲和性有关。 如 肺部 pO2 高： 两者对氧的亲和性都高，几乎都被饱和。 肌肉等组织的毛细管内，pO2低： 血红蛋白氧亲和性低，红细胞中血红蛋白的氧被释放， 肌红蛋白结合由血红蛋白释放出来的氧。,问你：氧是如何从肺部转运到肌肉的？,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病是蛋白质错误折叠,表现：共济失调的症状后又发生兴奋性增加和流涎症状,正常,疯牛病,疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠,正常,疯牛病,第五节,蛋白质的性质 The Physical and Chemical Characters of Protein,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,正电蛋白,等电蛋白,负电蛋白,蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:,等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 使蛋白质溶液等电状态时溶液的pH,利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。,每种蛋白质都有它特有的等电点， 这也是鉴别蛋白质的指标之一。,A：染色后显示的蛋白质区带 B：光密度扫描定量分析,例如:血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白。,蛋白质的分子量测定,（二）胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,蛋白质(亲水胶体) 稳定的因素 分子表面电荷 水化膜,透析用于分离纯化蛋白质,透析,沉降系数（sedimentation coefficient, S),指溶质颗粒在单位力场中的沉降速度 （ 1S10-13秒）。 沉降系数与物质的分子量的大小、形状、密 度及溶剂的密度高低有关: 分子量越大，颗粒越紧密，沉降系数越大。,60 00080 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动。,超速离心法：,蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关 ： 相对分子质量越大，S值越大。 蛋白质的沉降系数：1200S 由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg 方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ：溶剂的密度,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,1、蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,变性的本质: 破坏非共价键和二硫键， 不改变蛋白质的一级结构。,造成变性的因素：如加热、强酸、强碱、 有机溶剂、重金属离子及生物碱试剂等 。,蛋白质变性后的性质改变：,（1）生物活性丧失（构象改变）。 （2）溶解度降低、易于沉淀； 粘度增大、扩散系数变小等。 （3）疏水基团外露，导致光学性质变化。 （4）对蛋白酶降解的敏感性增大，易被降解。,应用举例 消毒及灭菌。 保存蛋白质制剂（如疫苗等）防止变性,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,复性(renaturation),尿素、-巯基乙醇,去除变性试剂,牛核糖核酸酶的变性与复性,例： 温度8090 失去溶解性，无催化活性 胃蛋白 温度降低到37 又恢复催化能力,2. 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,酸、中性盐、有机溶剂、重金属盐和生物碱试剂, 高浓度中性盐 如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可破坏蛋白质的水化层 盐析现象：中和蛋白质的电荷，从而使蛋白 质沉淀析出，称为盐析（用于蛋白质的分离制备）。 盐溶作用：球蛋白通常不溶于纯水，而溶于稀中性盐溶液，其溶解度随稀盐浓度的增加而增大的现象称为盐溶。,分段盐析法：,调节盐浓度使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出的方法。如 血清中蛋白质+半饱和硫酸铵 析出球蛋白 血清中蛋白质+饱和硫酸铵 析出清蛋白, 有机溶剂 丙酮、乙醇等有机溶剂可破坏蛋白质分子水化层，导致其沉淀析出。（因为有机溶剂比蛋白质有更强的亲水作用，可作为脱水剂。） 重金属盐 Hg2+、Ag+、Pb2+等金属离子可与蛋白质中带负电的基团形成不易溶解的盐而沉淀。 生蛋清或牛奶可解毒，可防止有害离子被吸收。 生物碱试剂（某些酸类物质） 苦味酸、三氯乙酸、单宁酸、钼酸、钨酸等生物碱试剂可与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐而析出。,3、蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的颜色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,茚三酮反应(ninhydrin reaction) -氨基与-羧基共同参加的反应 与茚三酮的反应：除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。,氧化脱氨脱羧,1. 氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨脱羧反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。,2. NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成紫色化合物。,1.,2.,3,NH3,红紫色络合物,(硷性溶液),Cu2+,两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物； 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应； 肽键越多颜色越深； 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度。,2. 双缩脲反应,蛋白质的颜色反应,OH,N,第六节,蛋白质的分离纯化与结构分析 The Separation, Purification and Structure Analysis of Protein,蛋白质的理化性质与常用的纯化方法,一、蛋白质的分离和纯化,蛋白质粗制品分离的一般步骤: 1.材料的预处理及细胞破碎 材料必须新鲜，蛋白质含量高。 机械破碎法 高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 渗透破碎法 利用低渗条件使细胞溶胀而破碎。 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使 细胞胀破。 对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而 使细胞破碎。 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。,抽提：把生物物质从生物组织中以溶解状态释放出来。 抽提液 = 离子强度调节剂 + pH缓冲剂 + 温度效应剂 + 蛋白酶抑制剂 + 抗氧化剂 + 重金属络合剂或 重金属 + 增溶剂 膜蛋白的抽提:加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、 tritonX-100等)膜结构破坏蛋白质与 膜分离。 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等以防止蛋白质的变性。,2、蛋白质的抽提:,二、蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,* 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,*免疫沉淀法： 将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。 利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。,（五）超速离心,* 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,三、多肽链中氨基酸序列分析,1. 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,2. 测定多肽链的N端与C端的氨基酸残基,3. 把肽链水解成片段，分别进行分析,4. 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,5. 经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,（一）改进的Sanger法,水解肽链的方法及特征,通过核酸推演的方法,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,蛋白质的分类,依据外形分类 1.球状蛋白质：（globular protein） 外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质