丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝癌细胞凋亡的关系.doc

丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝（癌）细胞凋亡的关系 【关键词】 ,C型肝炎病毒属 关键词: C型肝炎病毒属;癌，肝细胞;蛋白表达 摘 要:目的 探讨丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝（癌）细胞凋亡的关系及其意义. 方法 采用免疫组织化学方法检测HCV核心区抗原和NS3区抗原在肝硬变（LC）和肝细胞肝癌（HCC）组织中的分布，同时对连续切片进行原位凋亡检测并计算凋亡指数. 结果 HCV核心区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质或胞核中，在LC组织中，核心抗原呈弥漫或灶状分布于肝细胞胞质，偶见胞核阳性的肝细胞，阳性率为60.7%;核心抗原在癌组织中以核阳性分布为主，阳性率为37.6%，癌旁肝组织以胞质阳性为多见.HCC中HCV核心抗原的核阳性率（75.0%，15例/20例）明显高于其在LC（17.7%，6例/34例）及癌旁肝组织（11.8%，2例/17例）中的阳性率（P0.05）;在HCC中，HCV核心抗原核转位表达的癌组织的AI值（0.1740.093）显著低于胞质阳性的癌组织（0.5120.113，P0.01）.HCV NS3区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质中，在LC和HCC组织中的阳性率分别为53.6%和39.6%.未发现HCV NS3区抗原的表达与肝（癌）细胞凋亡的相关性. 结论 HCV感染与我国LC，HCC的发生关系密切，HCV核心抗原在肝癌组织中常发生核转位表达，这种核转位表达抑制了肿瘤细胞发生凋亡，从而促进肿瘤组织的进一步恶化. Keywords:hepatitis C-like virus;carcinoma，hepatocellular;protein expression Abstract:AIM To analyse expression of HCV core protein and apoptosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.METHODS Immunohistochemistry method was used to show the dis-tributive pattern of HCV core and NS3antigen.Modified in situ end labeling（ISEL）was conducted on the serial sections.RESULTS Immunohistochemistry showed expression of HCV core protein in the liver cirrhosis of34/56cases and HCC of20/53cases.In liver cirrhosis and pericancerous tis-sues，the signals were mainly localized in the cytoplasm of hepatocytes.ISEL showed that only cells expressing core protein might initiated apoptosis.In cancerous tissues，translocated expression of HCV core protein was observed in the nuclei of tumor cells.According to ISEL on serial sec-tions，all these positive tumor cells hardly exhibited apoptosis（AI for nuclear positive，0.174vs AI for cytoplasmic posi-tive，0.152，P0.01）.HCV NS3antigen was mainly dis-tributed in the cytoplasm of hepatocytes.We could hardly found the relationship between the expression of NS3and apoptosis in hepatocellular carcinoma.CONCLUSION HCV core protein may express in the nuclei of tumor cell.Translo-cated expression of HCV core protein may inhibit apoptosis in the tissue of hepatocellular carcinoma. 0 引言 自1989年Choo等克隆出丙型肝炎病毒（HCV）以来，各国学者从分子病理和免疫病理的角度寻找HCV与宿主相互作用的关系，进行HCV特异性抗原的表达与HCV相关性肝疾病之间关系的研究，证实HCV感染是肝硬变（LC）、肝细胞肝癌（HCC）发生的一个重要危险因素1 .肝（癌）细胞的凋亡与HCC的发生和发展有着密切的联系.研究表明HCV的感染与肝（癌）细胞的凋亡有关2 .HCV核心区和NS3区基因编码的蛋白具有较高的保守性.我们采用ABC法，对HCV核心区和NS3区抗原在LC，HCC组织中进行定位研究，进一步探讨HCV与HCC发生的关系. 1 材料和方法 1.1 材料 均为我院1994/1996年外科手术切除标本，其中LC56例，HCC53例，45例带有癌旁肝组织.所有标本经100mLL-1 福尔马林固定、脱水，常规石蜡包埋，制备5m厚连续切片，APES胶（Sigma，USA）对玻片进行处理以防脱片.HCV核心区抗原2B株单克隆抗体由军事医学科学院基础所惠赠.HCV NS3区抗原单克隆抗体由北京医科大学人民医院肝病研究所惠赠. 1.2 方法 采用Vector Lab公司生产的ABC试剂盒对石蜡切片经常规脱蜡至水后，进行免疫组织化学染色，根据操作手册进行，并做对照实验.连续切片进行HE染色.原位凋亡检测技术采用武汉博士德公司生产的原位末端标记试剂盒，根据操作手册和已有文献3进行，显微镜观察，对福尔马林固定石蜡包埋的组织片采用蛋白酶K（20mgL-1 ，15min，RT）消化和微波预处理.阴性对照为省去末端标记反应液，阳性对照用0.5gL-1 DNA酶I（Sigma，USA）预先处理组织.结果判定是以核阳性为判定标准，根据凋亡细胞的典型表现:染色质和细胞质显著浓缩，染色质聚集呈环状或新月体状，细胞质的碎片合并有或没有染色质的浓缩，细胞内或细胞外染色质碎片. 统计学处理:随机移动组织片，选择相邻的几个视野，计数1000个细胞中的凋亡细胞数作为凋亡指数（AI）.采用2 检验和t检验. 2 结果 2.1 HCV NS3区抗原的分布特点和检出率 应用HCV NS3区抗原单克隆抗体检测LC和HCC中的相应抗原发现:阳性信号见于肝细胞和癌旁肝细胞的胞质中，呈细颗粒状均匀分布，而在HCC细胞中少有表达.在LC及HCC组织中HCV的NS3区抗原的阳性率分别为53.6%（30例/56例）和39.6%（21例/53例）. 2.2 HCV核心抗原的分布特点和检出率 应用HCV核心区抗原2B株单克隆抗体检测LC和HCC中的相应抗原发现:阳性信号见于肝细胞、HCC细胞的胞核或胞质中，呈细颗粒状均匀分布.在LC中，核心抗原以胞质阳性为主，偶见胞核阳性细胞，分布多呈灶状，汇管区小胆管上皮细胞偶可见阳性（Fig1）.在癌组织中，核心抗原以弥漫或灶状核阳性分布 为多见，亦可见胞质阳性的HCC细胞（Fig2）.癌旁组织为弥漫或灶状分布的胞质阳性，分布类似于硬化组织（Fig3）.在LC及HCC组织中HCV核心抗原的阳性率分别为60.7%（34例/56例）和37.6%（20例/53例）.与NS3区抗原相比，核心抗原在HCC的癌组织中阳性率显著增加（37.7%vs7.5%，P0.05），而在癌旁肝组织和肝硬化组织中的阳性率无显著性差异（Tab1）.2 检验表明，HCC组织中的核心抗原的核阳性率（75.0%，15例/20例）明显高于其在LC（17.7%，6例/34例）及癌旁肝组织（11.8%，2例/17例）中的阳性率（P0.05）. 表1 HCV核心抗原和NS3区抗原在LC，HCC中表达的阳性率略 2.3 LC和HCC中凋亡细胞的特征及AI 结果显示，阳性信号为蓝紫色颗粒，位于胞核，呈小圆形或环行.有些阳性细胞见于肝窦中，大约10m左右的小圆形颗粒，其形态难与淋巴细胞和Kupffer细胞区分.在LC中，阳性细胞在小叶内多为散在分布于小叶周边，靠近汇管区居多（Fig4）.而在癌组织中，既有散在分布的又有成簇分布的阳性细胞（Fig5）.在癌旁肝组织中阳性信号较前者少见.连续切片染色发现，在LC中，HCV核心抗原阳性的细胞部分发生了凋亡，并且AI明显高于HCV阴性者（0.9730.210vs0.4390.172，P0.05）.比较HCV核心抗原阳性的HCC及其癌旁肝组织的凋亡指数，t检验显示，HCV核心抗原核心核转位表达的癌组织的AI值（0.1740.093）显著低于胞质阳性的癌组织（0.5120.113，P0.05），提示HCV核心抗原的核转位表达抑制了肿瘤细胞发生凋亡，从而促进肿瘤的进一步恶化.HCV NS3区抗原的表达与AI之间未发现显著的相关性. 3 讨论 大量的流行病学研究表明，HCV与LC，HCC的关系非常密切，至少50%的感染者发展为慢性肝炎，约10%20%最终发展为LC，甚至HCC4 .应用免疫组织化学方法对HCV相关抗原进行检测，可为其提供直接的证据.我们用HCV核心抗原和NS3区抗原的抗体检测HCV RNA表达产物的分布情况，发现HCV感染与LC，HCC的发生关系密切，有较高的检出率，分别为LC为60.7%和53.6%，HCC为37.6%和39.6%.结果显示，HCV核心抗原有胞质表达阳性，也有胞核阳性，且在癌细胞中的胞核阳性率明显高于其在LC与癌旁组织中的核阳性率.目前逐渐有关于核心抗原核表达阳性的报道.Suzuki等5 认为HCV核心抗原的核表达与HCV核心剪切蛋白的形成有关.他提出假说即表达全长cDNA的HCV的核心蛋白（Mr2200）定位于胞质是由于在C末端功能域中存在锚着序列，它可使HCV核心蛋白锚着在内质网膜上，而当C末端功能域受到细胞或病毒蛋白酶的编辑处理后，核心蛋白会转位到核内.并且发现PRRGPR（3843残基）的序列作为核定位信号起着重要的作用，这一序列在各种HCV株中都非常保守6 .另有研究表明HCV核心蛋白可能是一种基因调节蛋白5 .HCV可能通过其表达的蛋白产物间接致癌.认为HCV通过表达某种调节蛋白来影响肝细胞基因组的表达调控，从而向恶性发展. 图1 图5 略 目前，HCV核心抗原在HCC细胞中的核转位表达，越来越受到国内外学者的重视，推测它可能在HCC的发病机制中起一定的作用.有研究表明，HCV核心蛋白可在转录水平调节多种原癌基因及病毒基因的表达.针对HCV核心蛋白与Fas系统介导的细胞凋亡的关系的研究，提示在慢性肝炎和LC中，HCV核心蛋白可能在肝细胞凋亡中起着重要的促进作用7 .而最近有文献报道，HCV核心蛋白能够抑制某些细胞发生凋亡8 ，并可与ras协同作用促进大鼠胚胎纤维母细胞恶性转化9 .我们的研究结果显示，在硬变肝组织中HCV核心蛋白的表达与肝细胞的凋亡有关.而在癌组织中出现的核心蛋白的转位表达，又抑制了阳性细胞发生凋亡.HCV核心蛋白在细胞凋亡中表现的这种不一致性使我们推测HCV在慢性肝炎的进展过程中为了阻碍宿主细胞的防御功能，逐渐具备了扰乱宿主细胞凋亡调控机制的能力，即由诱导转位抑制细胞发生凋亡，并促进宿主细胞的恶性转化，最终导致HCC的发生.因此研究HCV核心蛋白对多种凋亡相关基因的调控作用就显得十分重要.HCV与细胞凋亡调控机制的研究目前尚属少见.因此，以HCV核心蛋白为研究的突破口，探索其在HCV致病和致癌机制中的确切作用，并进而为研究针对HCC的防止措施提供重要的理论和临床依据. 参考文献: 1Urdea MS，Wuestehube LJ，Laurenson PM，Wilber JC.Hep- atitis C diagnosis and monitoring J.Clin Chem，1997;43（8）:1507-1511. 2Higaki K，Yao H，Kojiro M.Fas antigen expression and its re-lationship with apoptosis in human hepatocellular carcinoma and non cancerous tissues J.Am J Pathol，1996;149（2）:429-437. 3Li J，Wang WL，Li YS，Liu B.TUNEL assay of apoptosis in human hepatocellular carcinoma under laser confocal microscope J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（2）:102-105. 4Hino K，Higashi T，Nouso K，Nakatsukasa H，Tsuji T.Apop-tosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma J.Liver，1996;16（1）:123-129. 5Suzuki T，Matsura Y，Harada T，Ando A，Chiba J，Harada S，Saito I，Miymura T.Nuclear localization of the truncated hep-atitis C virus core protein with its hydrophobic C-terminus delet-ed J.J Gen Virol，19