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病毒感染的实验诊断,王 跃 临床微免教研室,什么是病毒？,病毒（virus）是一类体积微小、结构简单、有严格的细胞内寄生性的非细胞型微生物。,特点： 体积微小，只能在电镜下观察，能通过滤菌器 无完整的细胞结构：蛋白质衣壳核酸核心 只有一种类型核酸：RNA或DNA 有严格的细胞内寄生性，只能在活细胞内生长 以核酸复制的方式增殖，不能进行二分裂繁殖 抵抗力特殊：耐冷不耐热，对化学因素的抵抗力较一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不敏感，干扰素可抑制病毒复制。,病毒感染的实验诊断方法,病原学诊断 病毒分离培养 显微镜检查 抗原检测 核酸检测 血清学诊断 抗体检测 IgM、IgG,一、标本采集、运送和处理,（一）标本采集 采集时间：尽早采集（越早越好） 标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择标本种类 无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理 抑制细菌生长 100U/ml青霉素100g/ml链霉素 抑制真菌生长 2.5g/ml二性霉素B 或40 g/ml制霉菌素 血清学检查标本：双份血清,（二）标本的运送与保存,1.低温送检 4可保存数小时，-70可长期保存 -10 -20下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 对冷冻标本应避免反复冻融 2.保湿送检 50%甘油盐水保存送检 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明胶或牛血清白蛋白的Hanks液 3.无菌送检 抑制细菌生长 100U/ml青霉素100g/ml链霉素 抑制真菌生长 2.5g/ml二性霉素B 或40 g/ml制霉菌素,二、病毒的形态学检查,1. 光学显微镜检查 主要观察病变组织中的包涵体，某些大病毒也通过光学显微镜观察。 简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形成包涵体,2. 电镜及免疫电镜检查,直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。但敏感性低（106/ml） 免疫电镜敏感性高，但只能用于已知病毒的检测）,乙型肝炎病毒电镜图,轮状病毒电镜图,三、病毒的分离与鉴定,（一）病毒的分离,组织培养 鸡胚培养 动物接种,将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。 组织培养的类型: （1）组织块培养 （2）器官培养 人胚气管呼吸道病毒； 人胚肠 肠道病毒 （3）细胞培养 最常用 原代和次代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞培养,动物新鲜组织（人胚肾等）胰酶消化营养液培养单层细胞（原代细胞） 原代细胞胰酶消化转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传23代。,原代和次代培养细胞,二倍体细胞株 原代细胞反复传代（5070代）仍保持二倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。 传代细胞株 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在体外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。,优点 细胞来源广、敏感细胞株多 不受机体免疫因素的影响，个体差异小 病变结果易于观察 可用于病毒的分离鉴定和制备疫苗及抗原 缺点 条件要求相对较高，有细胞培养条件的实验室才能做,2. 鸡胚培养,新鲜受精卵 接种病毒,3839 713d,卵黄囊接种（流行性脑炎病毒） 羊膜腔接种（流感病毒） 尿囊腔接种（传代培养） 绒毛尿囊膜接种（痘类病毒）,绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤,优点 鸡胚来源充足，操作简便，有多种接种途径 病毒增殖快，可收获大量病毒 鸡胚本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗体 缺点 易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养。 某些病毒在鸡胚内传代后，其毒力下降,3. 动物接种,常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。 接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径： 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 流感病毒 鼻腔滴种 用途 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清,优点 方法简单、结果易于观察 选择适当的接种途径，可出现类似人类的感染症状，有利于发病机制的研究 缺点 可自然带毒或隐性感染，干扰实验结果 有个体差异 很多病毒无敏感动物，或感染后不出现明显症状,（二）病毒的鉴定,病毒的初步鉴定 动物感染：敏感动物范围、潜伏期及发病情况 鸡胚接种：病毒对鸡胚的敏感性、特殊病灶（如痘疱等） 细胞培养：病毒在细胞培养中的表现 理化性质的测定：主要用于新病毒的鉴定 病毒的最后鉴定 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等。 分离的新病毒，必须进行系统的全面鉴定,病毒在细胞培养中的表现,1. 细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红,病毒在细胞内增殖后，使宿主细胞的形态发生不同程度改变，称为细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。,2. 细胞形态改变,细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。 某些病毒感染细胞后不出现CPE,3. 干扰现象（interference） 当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。 干扰现象也可被相应特异性抗体抑制，称为干扰抑制现象,4. 红细胞吸附及吸附抑制试验,受感染的宿主细胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。 如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清，则不出现红细胞吸附现象，即红细胞吸附抑制试验阳性,病毒的理化性质测定,主要用于新病毒的鉴定 1. 病毒的大小及形态 ：电镜直接观察及测量 2. 核酸类型: 用RNA酶或DNA酶处理病毒。 3. 乙醚敏感试验: 有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性 4. 耐酸试验 肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，在pH3的环境下被灭活,病毒的血清学鉴定,对初步鉴定为阳性的标本均需要用血清学方法做最后鉴定。 方法：血凝抑制试验、中和试验、免疫荧光试验、ELISA等。,四、病毒的血清学诊断,用已知病毒抗原检测患者血清中的相应抗体，可协助诊断病毒感染。 双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义 单份血清IgM测定 可用于早期诊断，但部分病人可能阴性，少数病人产生的特异性IgM抗体也可在体内持续存在12年。,病毒血清学试验常用方法,（一）中和试验 原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。 V.Ab 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒 根据抗体的效价对待测病毒液进行半定量检测。 中和试验的必要条件： 1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物,中和试验的特点： 特异、敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。 既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞培养法最常用。 检测IgG，不能用于早期诊断，常用于流行病学调查。,（二）补体结合试验,检测IgM，常用于早期诊断。 不需活细胞，比中和试验简单，省时。 （三）IF及ELISA 方法简单、快速、敏感性高。 检测特异性IgM，有助于某些病毒感染的早期诊断，如： 孕妇羊水中检测IgM型特异抗体：胎儿先天性感染 抗HBc IgM：作为急性HBV感染的指标,（四）血凝及血凝抑制试验,含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于病毒的分型。,五、病毒抗原检查,DFA、IFA、IEA等。 可检测细胞内、外