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大鼠羊膜上皮细胞神经营养因子基因的表达 作者：董智勇 李忱 陈东 孟晓婷 李玉林【摘要】 目的 建立胚胎不同时期羊膜上皮细胞（AECs）表达脑源性神经营养因子（BDNF）与神经营养素3（NT3）mRNA的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期。方法 采用实时荧光定量PCR检测胚胎不同时期（11，13，17，21 d）AECs中BDNF与NT3 mRNA的表达差异。结果 绘制出大鼠AECs中BDNF、NT3的基因表达差异时程图：BDNF的表达随着胚胎发育持续上调，至17 d达到最高，然后其表达开始下调；NT3的表达在13 d达到最高，然后开始下调。结论 初步确定1317 d是大鼠AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期。 【关键词】 羊膜上皮细胞；脑源性神经营养因子；神经营养素3；实时荧光定量PCR【Abstract】 Objective To investigate the differences of BDNF and NT3 gene expression of the amnion epithelial cells (AECs) from pregnancy rats and establish the phase diagram of gene expression to find the best time of BDNF and NT3 secretion. Methods The differences of BDNF and NT3 gene expression of the amnion epithelial cells (AECs) from different phase of pregnancy rats (E11, 13, 17 and 21 days) were detected by real time PCR. Results BDNF mRNA was upregulated and lasted with embryonic development, reached the peak on E17 d, and then was downregulated. NT3 mRNA reached the peak on E13 d, and then was downregulated.Conclusions The best time of BDNF and NT3 secretion of AECs are from E13 d to E17 d. 【Key words】 Amniotic epithelial cells; Brain derived neurotrophic factor; Neurotrophin3; Real time PCR羊膜上皮细胞（AECs）是羊膜的主要细胞成分，实验证明人AECs（HAECs）可合成释放神经营养素3（NT3）与脑源性神经营养因子（BDNF）等多种营养因子1，移植到帕金森（PD）鼠纹状体的HAECs能够存活并分泌BDNF、NT3，使PD模型鼠的行为学症状在细胞移植后2个月内得到改善2。同时本课题组应用实时荧光定量PCR（RTPCR）、Western印迹证明大鼠AECs（RAECs）中也有BDNF、NT3 mRNA、蛋白质的表达；RAECs（E1516 d）的条件培养基可以促进神经干细胞（NSCs）的存活与神经分化3。因此，RAECs可以作为细胞模型代替HAECs研究AECs在胚胎发育过程中的作用。本研究应用RTPCR建立胚胎不同时期AECs表达BDNF、NT3 mRNA的时相图，找出AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期，为AECs应用于临床奠定实验基础。1 材料与方法1.1 材料 Trizol试剂购自北京博奥生物公司；引物合成由北京博奥生物公司完成；RTPCR仪（Roche公司Light Cycle PTC225）； Lightcyclerfaststart DNA master SYBR green （购自Roche公司）；孕期1121 d Wistar大鼠，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。1.2 总RNA提取 取胚胎不同时期（11、13、17、21 d）新鲜羊膜上皮组织，应用Trizol法提取组织总RNA。取100 g羊膜上皮组织于冰上剪成1 mm3小块，加入1 ml Trizol液，反复吹打，离心；用吸管取上清放入1.5 ml离心管中，室温放置10 min；加入200 ml氯仿混匀，室温放置3 min，4 离心15 min(12 000 r/min)；吸上清至另一离心管中，加异丙醇500 ml，室温放置10 min。离心沉淀，弃上清，沉淀用70%的冷乙醇洗1次，倒置管，自然干燥；每管加20 l 1DEPC水溶解RNA，取10 l RNA作逆转录，其余-70 冻存备用。1.3 RNA质量鉴定 用紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，A260与A280比值在1.82.0之间，基本无蛋白质污染。RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳后，28与18S条带清晰集中，比值大于2，表明RNA样品未降解。1.4 cDNA合成 取2.5 g总RNA反转录形成cDNA，方法同前。反转录合成：依次加入RNA 4 l，Oligo dT 1 l，DEPC 水4 l；65 水浴10 min，冰浴5 min；然后加入Rnase抑制剂0.5 l，5缓冲液4 l，dNTPs(10 mmol/L) 2 l，AMV 1.5 l，DEPC水3 l，终体积20 l。42 90 min。-20保存备用。1.5 RTPCR 使用Roche公司Light Cycler PCR仪，试剂为Lightcyclerfaststart DNA master SYBR green 。NT3引物：上游5CTCAGCCATTGACATTCGG 3，下游5AGTGCTCGGACGTAGGTTT3。BDNF引物：上游5CAGTATTAGCGAGTGGGTCA3，下游5GATTGGGTAGTTCGGCATT3。GAP引物：上游5TGCTGAGTATGTCGTGGAG3，下游5GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT3。实验体系：镁离子浓度3 mmol/L，引物浓度0.4 mol/L，退火温度60，95预变性10 min；95 10 s，60 5 s，72 15 s，78测定荧光强度，重复40个循环；75至95绘制溶解曲线。PCR产物2 l在1.5琼脂糖凝胶电泳。1.6 数据分析 绘制时程规律图。2 结果 以归一化后的基因表达量差异为最终结果，根据孕期大鼠11、13、17、21 d羊膜上皮表达BDNF、NT3的基因表达差异绘制时程图，结果显示：BDNF的表达持续上调，至17 d达到最高，然后其表达开始下调；NT3的表达在13 d达到最高，然后开始下调。见表1。表1 E11E21 BDNF、NT3归一化后的基因表达量差异（略）3 讨论 AECs是羊膜的主要细胞成分，在神经发生早期，羊膜直接与神经上皮联系，在神经发育及向羊水中释放类似神经递质与NTFs的过程中扮演着重要角色。大量实验表明AECs是细胞移植治疗中枢神经系统疾病的理想细胞：首先AECs与神经组织具有一定的相似性与同源性，能与神经组织有机整合；在胚胎发育上，AECs和神经组织共同起源于内细胞团的外胚层细胞；免疫组织化学等技术证实在AECs中不仅有神经组织特异性抗原如神经元特异性抗原微管相关蛋白（MAP2）、星形胶质细胞特异性抗原胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）及少突胶质细胞特异性抗原（MBP）等的表达4，而且具有合成释放乙酰胆碱、儿茶酚胺及多巴胺、去甲肾上腺素等多种神经递质的功能1。其次AECs可以合成释放NT3、BDNF等多种营养因子1，促进神经元的存活与轴突再生。BDNF是一种重要的运动和感觉神经元营养因子,是神经元的自分泌/旁分泌因子,对神经元，尤其是多巴胺能神经元有显著的营养和保护活性,能够促进其存活、分化,并能保护其不受神经毒素等的损伤5；可以促进脊髓损伤后红核脊髓束的再生和功能恢复，增强轴突生长能力，并且能够克服轴突生长抑制物MAG的作用6； NT3是神经营养素家族主要成员,具有较广泛的生物学活性,可促进多种中枢和外周神经元的分化、发育、存活及再生修复,并参与调节神经元突触活动7。国内外已有多名学者将AECs移植治疗中枢神经系统疾病，如帕金森2，8、脑缺血9、脊髓损伤等10。本文前期研究结果还表明，AECs的条件培养基可以明显促进神经干细胞的存活分化3。那么，胚胎不同时期的AECs其BDNF、NT3的表达是否存在差异呢？如果可能，能否找到AECs分泌BDNF、NT3的最佳时期呢？ 本实验中选择孕期11、13、17、21 d的RAECs，应用RTPCR检测BDNF、NT3 mRNA的表达，并根据大鼠BDNF、NT3的基因表达差异绘制时程图。RTPCR是PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。与常规PCR检测相比，具有高精确度，高灵敏度的优势，能忠实反映样品中mRNA的丰度。本结果可以初步确定1317 d是RAECs分泌BDNF、NT3的最佳时期。【参考文献】 1 Uchida S，Inanaga Y，Kobayashi K,et al.Neurotrophic function of conditioned medium from human amniotic epithelial cellsJ.J Neurosci Res，2000；62(4):58590.2 朱 梅，陈 东，孟晓婷，等.羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病大鼠的实验研究J.中国老年学杂志，2006；26（2）：2279.3 Meng XT,Chen D,Zhiyong Dong ZY,et al.Enhanced neural differentiation of neural stem cells and neurite growth by amniotic epithelial cells cocultureJ.Cell Biol,2007；31(7):6918.4 孟晓婷，陈 东，刘佳梅.神经组织细胞特异性蛋白在大鼠羊膜上皮细胞中的表达J.中国康复理论与实践，2004；10（1）：178.5 Dluzen DE，Mcdermott JL，Anderson LI,et al.Agerelated changes in nigrostriatal dopaminergic function are accentuated in +/brainderived neurotrophic factor miceJ.Neuroscience，2004;128（1）：2018.6 Namiki J,Kojima A，Tator CH.Effect of brainderived neurotrophic factor，nerve growth factor，and neurotrophin3 on functional recovery and regeneration after spinal cord injury in adult ratsJ.J Neurotrauma，2000;17（12）:121931.7 David MY，Anita FT.Differential expression of GDNF，BDNF，and NT3 in the aging nigrostriatal system following a neurotoxic lesionJ.Brain Res，2001;891（12）：22835.8 Kakishita K，Elwan MA，Nakao N,et al.Human amniotic epithelial cells produce dopamine and survive after implantation into the striatum of a rat model of Parkinsons disease：a potential source of donor for transplantation therapyJ.Exp Neurol，2000；165(1):2734.9 Okawa H，Okuda O，Ar