小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达.doc

小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达【摘要】 目的: 克隆酪氨酸酶基因（TYR）, 并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白, 体外测定纯化的TYR活性。方法: 利用RTPCR技术, 从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR, 克隆至pMD18T载体, 进行双链核苷酸序列测定。构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaA TYR并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115, 表达的重组蛋白用SDSPAGE和Western blot进行分析, 采用Co2+离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性。结果: 克隆了TYR基因。构建了重组表达质粒pPICZaATYR。SDSPAGE和Western blot分析显示, 在相对分子质量(Mr)为约53 000处出现1条特异性蛋白带, 且能与兔抗TYR抗体发生反应。结论: 克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致, 并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性。 【关键词】 酪氨酸酶基因 黑色素瘤细胞 毕赤酵母酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)由酪氨酸酶基因（TYR）编码产生, 是黑色素生物合成途径中的关键酶, 其含量和活性直接影响着黑色素生成的速度和产量。黑色素具有独特的结构和性质, 功能多种多样, 在人体主要存在于皮肤、 眼睛及脑黑质等组织, 对人体提供某种形式的保护作用, 但其作用机制尚不清楚。由TYR结构改变或表达失控所导致酪氨酸酶的量或者活性发生改变临床上会引起多种色素性皮肤病的发生1。临床上许多皮肤病: 如黄褐斑、 色素痣、 白癜风、 白化病等均是由TYR结构改变或表达异常导致酪氨酸酶的量或活性发生改变所引起。基因突变、 酪氨酸酶活性异常升高、 黑色素合成过度增加被认为是恶性黑色素肿瘤的起因, 某些神经性疾病如着色性干皮病, 帕金森氏综合症、 老年痴呆症都与黑色素缺乏有关, 这些疾病均为难治疗性疾病, 目前尚未有特异有效的治疗方法。因此寻找调控TYR表达的有效方法对由TYR表达失控引起的多种难治疾病的防治具有重要意义。1 材料和方法1.1 材料 总RNA抽提试剂TRIzol试剂购自Pharmacia公司; DNA聚合酶为TaKaRa公司产品; 兔抗TYR抗体由本研究室制备; Superscript OneStep RTPCR试剂盒、 zeocin、 Pichia pastoris表达菌株GS115和表达载体pPICZaA为Invitrogen公司产品; 酵母提取物和蛋白胨为Oxoid公司产品; YPDS平板(20 g/L蛋白胨, 10 g/L酵母提取物, 20 g/L葡萄糖, 1 mol/L山梨糖醇, 20 g/L琼脂粉); BMGY培养基(13.4 g/L YNB, 20 g/L蛋白胨, 10 g/L酵母提取物, 0.04 g/L生物素, 100 mmol/L磷酸缓冲液pH6.0, 10 mL/L甘油); BMMY培养基 (13.4 g/L YNB, 20 g/L蛋白胨, 10 g/L酵母提取物, 0.04 g/L生物素, 100 mmol/L磷酸缓冲液pH6.0, 10 mL/L甲醇)。Co2+NTA琼脂糖介质为qiangen公司产品。限制性内切酶、 DNA Marker、 dNTP、 T4 DNA连接酶、 克隆载体pMD18等购自TaKaRa公司; PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成。1.2 方法1.2.1 小鼠B16黑色素瘤细胞株常规传代培养 用含150 mL/L 胎牛血清, 青霉素和链霉素各100 mg/L的RPMI1640, 37、 50 mL/L CO2饱和湿度环境培养1824 h, 待细胞生长至对数生长期, 用2.5 g/L胰酶消化, 计数并收集细胞即可抽提其RNA。TRIzol试剂抽提小鼠B16黑色素瘤细胞的总RNA, 以14 g/L琼脂糖凝胶电泳检测有无降解, 紫外分光光度仪测定其浓度及纯度。1.2.2 TYR的cDNA克隆 参考小鼠的已知TYR基因序列(GenBank Accession Number D00440)利用DNAstarprimerSelect计算机软件设计如下PCR引物: Primers P1(sense)5GCGAATTCATGTTCTTGGCTGTTTTGTATTGCC3(EcoR I site underlined), P2(antisense) 5GCCTCGAGTCACAGATGGCTCTGATACAGC3(Xho I site underlined), 采用一步法RTPCR合成目的基因, 操作过程按TITANIUMTM OneStep RTPCR Kit推荐的程序进行。 把一步法RTPCR产物用8 g/L的琼脂糖凝胶电泳分离后, 割胶回收目的片段, 并直接经T/A克隆连接入pMD18T载体中, 通过菌液PCR进行初步鉴定后进行DNA测序鉴定。1.2.3 重组表达载体pPICZAHisTYR 的构建 引物的设计合成 根据重组质粒pMD18TTYR的测序结果与GenBank中的D00440（GenBank Accession Number D00440）序列, 结合pPICZA载体的特点设计引物,引物的核苷酸序列如下: 5CCGCTCGAGATGTTCTTGGCTGTTTTGTATTGCC3; 5 ATGGTGATGGTGATGTCACAGATGGCTCTGATACAGC3; 5GCTCTAGACTAGTGATGGTGATGGTGATGTCAATTC3; 其中引物中的单下划线序列为内切酶Xho I的酶切位点; 引物中的双下划线序列为连续5个组氨酸的核苷酸序列; 引物中的单下划线序列为内切 酶Xba I的酶切位点, 双下划线序列为连续6个组氨酸的核苷酸序列, 点式下划线为终止子序列。 首先以稀释的质粒pMD18TTYR为模板, 引物和为上下游引物进行PCR 扩增反应, 获得的片段为一端含有内切酶Xho I的酶切位点, 另一端含有5个组氨酸核苷酸序列的TYR基因序列, 命名为 5HisTYR。接着再以稀释的5HisTYR为模板, 引物和为上下游引物进行PCR 扩增反应, 获得的片段为一端含有内切酶Xho I酶切位点, 另一端含有内切 酶Xba I酶切位点的所需片段HisTYR。PCR产物经Xho I和Xba I双酶切后克隆至pPICZaA表达质粒, 经酶切及测序鉴定得到重组表达质粒pPICZaATYR。1.2.4 pPICZaATYR 转化毕赤酵母 取80 L感受态细胞分别与10 L (510 mg/L) Sac I线性化的pPICZaA和重组表达质粒pPICZaATYR混合, 于BioRad Gene Pluser电转仪下电转化(电压: 1500 V; 电容: 25 F; 电阻: 400 ; 电激次数: 1次/管; 时间参数: 8.9 ms), 涂布于YPDS (Zeocin 100 mg/L)抗性选择平板上筛选转化子。1.2.5 TYR在毕赤酵母中的诱导表达及检测 挑取酵母转化子单菌落接种于100 mL BMGY中, 置于500 mL锥形瓶中, 在30、 250300 r/min摇瓶培养至A600=26(大约1618 h), 酵母细胞达到对数生长期。3 000 r/min, 室温下离心菌体5 min, 去上清, 菌体重悬于100200 mL BMMY中, 至A600=1。将菌体置于500 mL锥形瓶中, 盖上两层纱布, 继续摇瓶培养。每隔24 h加入甲醇至终浓度5 g/L, 保持诱导。每隔0、 4、 48、 72、 96 h, 收集培养物1 mL, 12 000 r/min离心1 min, 取上清贮于-20, 等待分析。将发酵上清液进行SDSPAGE电泳(50 g/L浓缩胶, 120 g/L分离胶), 并用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。将电泳凝胶上的蛋白转印到硝酸纤维素膜上, 用兔抗TYR抗体进行Western blot分析。1.2.6 TYR 蛋白的大量纯化 产物经Co2+NTA HisoBind离子纯化柱纯化、 复性。加酵母上清液（含目的蛋白）至树脂中, 轻轻混合35 min, 然后用10倍体积的pH8.0的20 mmol/L磷酸钠、 300 mmol/L氯化钠溶液冲洗纯化柱。目的蛋白用含有150 mmol/L N烷基咪唑的pH8.0的20 mmol/L磷酸钠、 300 mmol/L氯化钠溶液洗脱, 具体步骤参照产品说明书进行。纯化的重组TYR蛋白可以用于活性测定实验。1.2.7 酪氨酸酶活性测定方法 采用酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性。反应混合物2 mL: 0.1 mol/L pH6.5 PBS 1.8 mL酪氨酸酶0.2 mL (20 mg/L)。37孵育10 min, 加1.5 g/L DL多巴1 mL, 2、 3、 4、 5、 6 min时, 用分光光度计测定A475值, 以每分钟A475增加0.001定为1个酶活力单位。以PBS液为空白, 蘑菇TYR反应组为对照, 测定TYR活性。2 结果2.1 TYR 基因cDNA的克隆、 表达和纯化 采用一步法RTPCR直接以小鼠B16黑色素瘤细胞总RNA为模板扩增出了1条特异的目的产物, 大小在1 700 bp左右, 与预期大小一致。将一步法RTPCR产物经割胶纯化后直接与pMD18载体连接, 转入DH5, 挑取白色菌落, 小量培养后做菌液PCR, 鉴定阳性克隆。序列分析表明, 基因总长度为1 700 bp, 包含完整的读码框, 将测得的基因序列在NCBI上进行BLASTN分析, 发现与GenBank中的基因登录号为D00440的核苷酸序列相差2个碱基, 这些差异没有导致保守氨基酸的改变。图1 小鼠B16黑色素瘤细胞TYR cDNA的克隆（略）1: 阴性对照; 2: 通过RTPCR克隆的小鼠B16黑色素瘤细胞TYR基因; M: DNA marker.2.2 重组表达载体pPICZATYRHis的酶切鉴定 对已经构建好的重组表达载体pPICZAHis TYR进行酶切检测（图2）。其中图中标注1的泳道为空载体。pPICZA用Xba I与Xho I双酶切作为阴性对照。从图中可以看出酶切下来的带为1 660 bp,载体酶切后与阴性对照在同一位置为 3 500 bp,与预期相符, 因此可进行下一步实验, 进行测序工作, 检测序列的读码框是否正确。图2 重组质粒pPICZTYR的酶切鉴定（略）M: DNA marker; 1: 经Xho I酶切的重组质粒pPICZTYR; 2: 经Xba I酶切的重组质粒pPICZTYR; 3: 经Xho I和Xba I双酶切的重组质粒pPICZTYR.2.3 重组表达载体pPICZATYRHis表达后的SDSPAGE分析 以空载体pPICZA诱导表达后的酵母上清液与重组表达载体pPICZATYRHis在毕赤酵母中诱导前的酵母上清液作为对照, 诱导后每隔24 h取上清夜作为样品, 共4次样品（分别为第、 、 、 天的上清液）, 进行SDSPAGE分析（图3）。2.4 TYR 在毕赤酵母中的表达及纯化后的SDSPAGE 分析检测 根据重组表达载体pPICZATYRHis在毕赤酵母中的小量表达分析, 按照最大表达量的原则, 选取最适纯化时间, 进行大量表达与纯化。SDSPAGE 分析结果见图4。SDSPAGE结果显示, 表达菌在相对分子质量（Mr）约53 000附近有一新生蛋白条带, 经Western blot分析结果显示该条带在硝酸纤维素膜上相应位置处可与兔抗TYR抗体发生特异性结合反应, 而相同条件下培养的对照菌则无此条带(图4)。图3 重组表达载体pPICZA TYR His在毕赤酵母中表达后的SDSPAGE分析（略）14: 重组表达载体pPICZATYR His在毕赤酵母中用5 mL/L甲醇诱导1、 2、 3、 4 d后的酵母上清夜; 5: 重组表达载体pPICZATYR His在毕赤酵母中诱导前的酵母上清液; 6: 空载体pPICZA在毕赤酵母中用5 mL/L甲醇诱导后的酵母上清液; M: 蛋白marker.图4 从酵母上清夜中亲和层析纯化TYRHis蛋白的SDSPAGE分析和TYR蛋白的Western blot分析（略）1: 纯化后的TYR蛋白Western blot分析; 2: 重组表达载体pPICZATYRHis在毕赤酵母中诱导前的酵母上清液Western blot分析; 3: 重组表达载体pPICZA在毕赤酵母中用5 mL/L甲醇诱导后的酵母上清液Western blot分析）; 4: 离子亲和层析柱纯化的TYRHis; 5: 重组表达载体pPICZATYR His在毕赤酵母中用5 mL/L甲醇诱导后的酵母上清液（ d）; 6: 空载体pPICZA在毕赤酵母中用5 mL/L甲醇诱导后的酵母上清液（ d）; M: 蛋白marker.2.5 TYR活性测定结果 TYR多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性结果如图5。图5 多巴速率氧化法检测TYR活性（略）3 讨论 近年来, 对恶性黑色素肿瘤的基因治疗方面的研究取得了一定的进展, 主要包括免疫基因治疗2, 3、 反义核酸与抗癌基因治疗4、 自杀基因治疗5及联合基因治疗6。一些学者将TNF、 IL2、 IFN等基因转染肿瘤淋巴细胞（TIL）, 再将转基因的TIL回输到恶性黑色素肿瘤患者体内, 取得了良好的抗瘤效果。另外, 近年来研究表明细胞凋亡异常在许多人体恶性肿瘤的发病学上占有十分重要的地位, 肿瘤细胞凋亡研究已成为人们普遍关注的一大热点, 诱导细胞凋亡已被证明是许多有效抗肿瘤药物化学治疗作用的重要机制。抗恶性黑色素肿瘤药物2, 3羟基桦木酸及榄香烯等的主要抗癌作用机制均是诱导黑色素瘤细胞发生凋亡7。 毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒 许多蛋白在毕赤酵母可得到高效地分泌表达胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列, 以引导重组蛋白进入分泌途径, 在本试验中所用pPICZA质粒, 含有分泌效率强的信号肽factor及组氨酸纯化标签, 有利于表达产物的纯化。此外, 还具有Zeocin抗性标记基因, 大大简化了重组质粒转化酵母的筛选过程。本研究中, 我们成功地扩增了TYR的全基因并对其在毕赤酵母中的表达进行了初步研究。酵母转化子经甲醇诱导后, 其菌体裂解液经SDSPAGE鉴定, 在Mr 约为53 000处出现1条明显的清导带, 同预期的结果相符 Western blot结果显示, 该特异蛋白与兔抗TYR抗体可发生反应, 表明我们获得了TYR的融合蛋白; 为更多的了解TYR的性质及采用使TYR失活的方法来治疗色素增高性皮肤病特别是黑色素瘤奠定了基础。【参考文献】 1 Kubo I, Yokokawa Y, KinstHori I. Tyrosinase inhibitors from Bolivian medicinal plantsJ. J Nat Prod, 1995, 58(5): 739-743.2 Rosenberg SA, Aebersold P, Cornetta K, et al. Gene transfer into humansimmunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumorinfiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transductionJ. N Engl J Med, 1990, 323(9): 570-578.3 Walsh P, Dorner A, Duke RC, et al. Macrophage colonystimulating factor complementary DNA: a candidate for gene therapy in metastatic melanomaJ. J Natl Cancer Inst, 1995, 8