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水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达 作者：武云涛 李祎 朱庆三 刘景臣【摘要】 目的 研究急性实验性脊髓不完全损伤水通道蛋白4(AQP4)的表达规律，探讨脊髓水肿的分子生物学机制。方法 建立兔急性脊髓不完全损伤动物模型，采用免疫组化方法、RTPCR检测脊髓损伤术后6 h、1、3、5和7 d时AQP4蛋白及其mRNA的表达变化。结果 脊髓损伤后AQP4及其mRNA表达即开始增加并持续上升，伤后3 d达到高峰，以后逐渐减少，二者的表达变化呈显著正相关。结论 AQP4参与了脊髓损伤后水肿的形成过程，AQP4过度表达可能是损伤性脊髓水肿的分子生物学机制之一。 【关键词】 水通道蛋白4；免疫组化 RTPCR；脊髓损伤；脊髓水肿急性脊髓损伤(acute spinal cord injury，ASCI)临床上常见，常致终生瘫痪，并引起各种并发症甚至死亡。文献报道水通道蛋白(AQP4)与生物体内水分的调节密切相关，在急性脊髓损伤时脊髓水肿的形成和消退中起重要作用1，2。脊髓水肿是脊髓损伤后的主要并发症之一，而且影响脊髓功能的恢复。本研究旨在探讨急性脊髓损伤后AQP4蛋白及其mRNA的表达变化规律，并对脊髓损伤后AQP4的表达与脊髓水肿的相关性进行分析，进一步探讨损伤性脊髓水肿的分子生物学机制。1 材料与方法1.1 材料45个月龄健康雄性新西兰大耳白兔48只，体重2.13.2 kg，平均2.7 kg。根据脊髓损伤造模成功后6 h、1、3、5、7 d五个时间点随机分成实验15组以及对照组，每组平均8只。主要试剂：抗兔AQP4抗体(博士德)；免疫组织化学检测试剂盒及DAB浓缩显色液(迈新)。1.2 方法1.2.1 建立急性不完全性脊髓损伤模型3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉。咬除兔T12棘突和椎板修剪成直径约0.4 cm的圆形骨窗，显露脊髓，在硬膜表面放置与骨窗直径一致的塑料垫片，用自制的改良Allen装置制备脊髓损伤动物模型。实验组参照预试验结果从3 cm高处击打，致伤能量60 gcm。造模成功标志：实验兔双后肢抽动后弛缓瘫。对照组只暴露脊髓节段，不打击脊髓。1.2.2 脊髓标本的采取实验组动物按照分组时间点、对照组动物于术后3d分别处死，以骨窗为中心，切取1.0 cm的脊髓段。将脊髓标本从中心点一分为二，一半于70低温保存，备RTPCR之用；另一半于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后用蒸馏水清洗12 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、4 m连续切片行免疫组织化学染色。1.2.3 脊髓损伤不同时段AQP4的表达切片常规脱蜡，3% H2O2室温浸泡10 min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗，PBS洗；滴加正常血清封闭20 min，弃血清，直接加一抗，室温下孵育过夜，PBS充分洗；滴加二抗室温下30 min，PBS充分洗；DAB显色镜下控制，自来水充分洗；苏木素染核，脱水透明，封片光镜观察。对照实验：取相同量的正常血清代替AQP4抗体，其余步骤同前。光镜下细胞膜上出现棕黄色颗粒为AQP4免疫阳性细胞。光学显微镜下观察切片，每只兔共染色3张切片，随机选择4处灰白质阳性表达区，用图像分析仪测量脊髓损伤不同时段平均光密度(OD)值，3张切片的均值为该只兔脊髓AQP4表达的OD值。1.2.4 RTPCR检测脊髓损伤不同时段AQP4mRNA的表达不同实验组和对照组脊髓组织各50 mg进行RTPCR分析，按Trizol试剂说明提取组织总RNA；采用MMLV逆转录试剂盒按操作说明逆转录成cDNA；产物进行PCR扩增。参照基因库基因序列设计引物，AQP4引物上游序列5TTGGACCATCATAGGCGC3，下游序列5GCATGTGATCGACATTGACC3，扩增片段长约214 bp；GAPDH 引物上游引物5GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3，下游序列5AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC3，扩增片段长约700 bp。RTPCR引物由联星公司合成。扩增条件：94变性40 s，58退火40 s，72延伸1 min，反应30个循环后，接72延伸10 min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统中观察并照相。1.3 统计学处理采用SPSS11.0统计软件处理，所有数据均采用xs表示，采用t检验分析，并分别对脊髓损伤不同时段AQP4染色表达OD值、AQP4 mRNA的表达水平进行Pearson相关分析。2 结果2.1 损伤脊髓的表达对照组脊髓AQP4在灰质和白质均有表达。脊髓灰质阳性细胞主要为神经胶质细胞，细胞膜呈棕黄色，顺中央管排列的室管膜细胞表达呈弱阳性，中央管室管膜周围、血管周围表达强烈，邻近毛细血管内皮细胞和神经元的胶质细胞突起表达亦非常丰富，神经元未见着色。脊髓白质内的纤维性星形胶质细胞、脊髓表面软脊膜也呈阳性表达，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得更加突出。损伤早期中央管周围和后角染色较深，随着时间的延长损伤部位及其周围的水肿区AQP4表达明显增强，而脊髓中央出现坏死、空泡形成的区域反而表达减弱，甚至无表达。实验1组，AQP4表达开始增加。实验3组，AQP4表达在损伤脊髓的水肿区达高峰，尤其在血管周围表达强烈，呈深棕色。随时间延长AQP4表达又逐渐减弱，实验5组表达仍稍高于正常水平。AQP4阳性表达主要位于损伤周围水肿区星形胶质细胞的细胞膜上，而胞浆及胞核未见阳性表达，镜下AQP4阳性细胞呈空泡状。2.2 AQP4染色OD值及AQP4mRNA的表达变化SCI后脊髓灰白质中均可见到AQP4表达明显增加。与对照组相比，实验1至5组脊髓损伤区OD值均有显著差异(表1)。RTPCR测定实验组中AQP4mRNA的表达显示：AQP4 mRNA扩增条带为214 bp，表达均呈阳性，与AQP4的表达相似；实验1组AQP4 mRNA开始表达上调，实验3组达到高峰，以后逐渐减轻，实验5组仍高于对照组水平(图1)，并且均有显著差异。线性回归分析结果显示，急性脊髓不完全性损伤后AQP4与其mRNA表达变化呈显著正相关(r=0.943，P0.05)。表1 急性脊髓不完全性损伤AQP4及AQP4mRNA的表达变化(略)3 讨论 AQP在脑脊髓中含量丰富，在脊髓水肿的形成和消退中起重要作用。Oshio等3通过RTPCR方法对AQPs表达，研究发现AQPs有四种亚型在正常成年大鼠脊髓内表达，AQP4表达最为强烈，而且证实AQP4在成年老鼠脊髓内主要位于灰质的神经胶质细胞和脊髓白质星形胶质细胞的血管周足上。本研究采用改良Allen法建立兔急性不完全性脊髓损伤模型。首先，观察到AQP4在对照组脊髓中的分布特点为：AQP4在灰质的分布明显多于白质，主要为神经胶质细胞的细胞膜着色，脊髓中央管周围、软脊膜以及血管周围呈极性分布，邻近蛛网膜下腔、毛细血管内皮细胞和神经元的胶质细胞突起表达非常丰富。AQP4分布特点充分反映其与脊髓水转运密切关系。本研究也发现AQP4及其mRNA在脊髓损伤后的表达是一个动态的变化过程，免疫组化从蛋白水平证实了AQP4表达于脊髓损伤6 h即开始增加，第3 d达到最高水平，随后开始下降，7 d时仍高于对照组。RTPCR结果又进一步从基因水平证实了AQP4的变化趋势与其蛋白含量变化相一致。Saadoun 等4实验表明，脊髓损伤后AQP4野生型(AQP4+/+)小鼠比AQP4基因敲除(AQP4/)小鼠出现更严重的肢瘫，脊髓损伤48小时后AQP4/小鼠神经细胞凋亡、髓鞘液化、脊髓肿胀、脊髓实质内压力等指标都较前者轻微。因此提示AQP4提供途径使过量的水分进入脊髓损伤区，从而引起脊髓水肿、脊髓压力升高。 本实验推论脊髓继发性损伤脊髓组织水肿的病理机制之一可能是损伤诱发了血脑屏障的星形胶质细胞胞膜上AQP4的表达，促进了水肿液能迅速通过毛细血管进入神经组织间隙所造成的。可以认为，发生中枢神经组织水肿时AQP4表达增加是星形细胞适应细胞外环境变化的反应，同时AQP4的过度表达又促进了星形细胞水肿的发生和发展，而AQP4表达的下调或缺无对减轻神经组织水肿程度、降低死亡率和致残率有重要作用。这一现象对人类高发病率、高死亡率SCI脊髓水肿的治疗有重大意义，提示AQP4抑制剂或负调节物可能是一个新的“神经保护作用因子”，将有益于SCI早期脊髓水肿的治疗。【参考文献】 1 Tait MJ,Saadoun S,Bell BA,et al.Water movements in the brain：role of aquaporinsJ.Trends Neurosci,2008；31(1)：3743.2 Papadopoulos MC,Verkman AS.Aquaporin4 and brain edemaJ. Pediatr Nephrol，2007；22:7784.3 Oshio K,Binder DK,Yang B,et al.Expression of aquaporin water channels in mouse spinal cor