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PCR常见问题、原因分析及其对策,北京天为时代科技有限公司,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物,含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件:退火温度太高,延伸时间太短,原因,对 策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间,现象:正对照有条带,而样品则无;,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR常见问题之二,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,原因,对 策,重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,非特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象:产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,PCR常见问题之三,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性(筛选转基因、检测基因表达情况),原因:靶序列或扩增产物的交叉污染,现象:空白对照出现目的扩增产物,对策: 操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外; 除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,提高PCR反应特异性的策略,巢式PCR(Nest-PCR),四种策略,递减PCR(TouchDown PCR),热启动PCR(HotStart PCR),使用PCR增强剂,策略之一,巢式PCR(Nest-PCR),巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性,因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度,并且提高了困难PCR(如5 RACE)的特异性。,策略之二,递减PCR(TouchDown PCR),递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。,特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如AFLP、DNA指纹分析等。,策略之三,热启动PCR (HotStart PCR),热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR 仪达到变性温度;,现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售,该酶具有热启动的性能,使用简单方便,适合于高通量应用;,热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一。,策略之四,使用PCR增强剂,甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。,其可能的机理是降低熔解温度,从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。,增强剂浓度要适当,谢谢!,北京天为时代科技有限公司 http/w
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