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酶快速反应动力学,Kinetics of Fast Enzyme Reaction,第一章 绪论,Introduction to Enzyme Kinetics,酶反应的稳态动力学和瞬变动力学 酶反应动力学是解释酶反应机制具有代表性的方法。酶动力学包括 两个方面，即酶的稳态动力学（Steady-state kinetics）和预稳态动力学 （Pre-steady state kinetics），后者也叫瞬变动力学（Transient kinetics）。 酶的稳态动力学的基本目标是对酶催化的总反应进行测量与分析， 只涉及底物与产物，而不考察酶分子本身。 预稳态动力学可以直接研究总反应中所包含的分步反应。研究者的 兴趣所在是酶分子本身所发生的变化或能够反映这种变化的变化上。 两种动力学方法各有其优缺点。稳态动力学由于所要求酶制剂用量 少，且不需要使用特殊的仪器设备，因而长久以来获得了广泛的应用。 这种方法的缺点在于研究人员所获得的信息是间接的，有时也是不确切 的。预稳态动力学由于测量快速反应，而需要特殊的仪器设备（例如， 停流装置）。它的优点是可以提供用来解释复杂反应机制的信息。应该 指出，两种方法是相辅相成的，对于研究酶反应来说都很重要。,从二十世纪60年代起，测量快速反应的技术发展很快，性能越来越好的 测量快速反应的装置（如，停流分光光度计等）被不断推出，这给研究 酶反应的瞬变动力学提供了很大的方便。 第一节 研究酶反应的历史 一. Henri 的工作 Henri 在1902年发表了一篇论文。他首次引入了一个十分重要的概 念，既酶与底物符合物的概念，并把它用到速度方程的推导中。随后， 他讨论和阐述了重要的酶反应的动力学特征，涉及到三种酶反应： 1. 蔗糖转化酶(Invertase) 催化蔗糖的转化； 2. 淀粉酶(Amylase)催化糊精的水解； 3. 苦杏仁酶(Emulsin)催化水杨苷的水解。 对实验结果归纳成如下几个要点： 1. 当底物浓度低时，酶催化的水解速度随底物浓度的增加而增加；,当底物浓度高时， 水解速度保持恒定。 2. 反应速度与酶浓度成正比； 3. 产物的加入引起反应速度的减少，在低底物浓度时，减少尤明 显。 上述实验结果可以用下面两种反应机制解释, 机制 I: (1.1.1) (1.1.2) 机制 II: (1.1.3) (1.1.4),如果考虑产物与酶结合生成EP，那么要把下述平衡包括到上述每 一个机制中去， (1.1.5) 在上述两种机制中，ES符合物的形成是共同的， 然而所起的作用 却是完全不同的。在机制 I 中，产物的形成是通过一个双分子过程（1. 1.2式），即酶与底物的碰撞。在此种情况下，ES符合物是无意义的， 它通过减少E浓度而降低产物的形成速度。另一方面，在机制 II中， ES 是至关重要的符合物，经过一个单分子过程（1.1.4式），ES复合物形成 产物。 下面要推导出能同时满足上述两种机制的速度方程。当考虑EP复 合物的形成时，酶以三种形式存在： E, ES 和 EP。 因此，酶的总浓度为 e0 = E0 = E + ES + EP (1.1.6) 假定在酶反应中，下述平衡迅速建立起来,应用质量作用定律， 有,(1.1.7),(1.1.8),其中，m和n 为平衡常数， x为底物在时间t时的浓度，那么， S=a-x， 这里a为底物起始浓度。P=x, 这是两个可以测量的量。 式1.1.6,1.1.7和1.1.8 组成一个联立方程组， 含有三个未知量。 E和ES的表达式为，,(1.1.9),(1.1.10),利用1.1.9和1.1.10式，产物P生成的速度方程可以推倒如下， 对于机制 I, P通过一个双分子过程形成，产物的生成速度为(下面式子应为k+1) 对于机制 II， 产物以单分子过程形成(1.1.4式) ，产物的生成速度 为： (1.1.11)和(1.1.12)式仅差一个常数。 为简化起见，只考虑反应的初相，可忽略产物的形成，因而 P=x 可以略去。 在t=0时，初始速度为 ，初始底物浓度为s0，ES解离常数为Ks=1/m,(1.1.11),(1.1.12),那么，我们可以把(1.1.11)和(1.1.12)式简化成如下形式， 其中，k0为比例常数，具有sec-1因次。 对机制 I ： k0 = Ks 为E和S间双分子反应速度常数； Ks为ES复合物解离常数。 值得注意的是Henri机制II（1.1.3和1.1.4式）和速度方程1.1.13式与著名 的Michaelis-Menden 机制和米氏方程相同。Henri是第一个得到为人熟 知的速度方程的人。 Henri 工作的特点： 由不同的反应机制出发得到了形式相同的速度 方程。换句话说，机制 I 和机制 II 不能用这里讨论的动力学方法加以区 别，因为我们无法估计速度方程中经过推导而演绎出的常数。这说明了 动力学方法的固有的限制，尽管两种机制可以借助于不同的动力学技术 加以区别。,(1.1.13),二. Michaelis and Menten 的工作 1913年Michaelis and Menten 重新做了蔗糖反应转化酶催化的蔗 糖水解反应的实验。他们改进了实验条件，克服了Henri实验的缺点，采 取了如下的措施： 1. 控制水溶液的pH，使用了pH4.5的醋酸buffer; 2. 考虑了产物的变旋影响，使用NaOH终止反应，加速产物的变旋作 用。 典型的实验曲线如Fig.1.1.1所示，,Fig.1.1.1蔗糖反应转化酶催化的蔗 糖水解反应的时间过程 最大底物浓度为0.333M; 最小底物浓度为0.0052M; 曲线1,2,3,.代表不同的底物浓度； : 产物完成变旋后反应混合物旋光度 的变化。 产物：Glucose and fructose.。,Henri在他的实验中测量的是反应速度常数，而Michaelis and Meten 建议利用反应初速度作为反应速度的一种测量。测量反应初速度的优点 在于可以消除产物可能产生的抑制作用以及在反应进行期间酶的钝化。 基于与Henri 机制 II相同的图示， （ 1.1.14) M-Menten 利用与Henri使用的基本相同的方法得到了一个速度方程。推 导如下： 假定E和S的结合是处于快速平衡，即 则ES的解离常数 （ 1.1.15),由物种守恒，有 e0 E0 = E + ES （ 1.1.16) 因只考虑反应初速度，固EP项可漏掉， 反应速度（初速度）为 = k+2 ES （1.1.17) 由1.1.15- 1.1.17式，有 （1.1.18) 其中 V=k+2 e0 为最大反应速度。与Henri 机制 II 比较，k0= k+2, 则 （1.1.18)式与(1.1.13)式相同。 1.1.18式就是Henri, Michaelis 和menten 推导 出的第一个讨论酶反应的速度方程。 快速平衡法的基本假定是下述平衡,迅速地建立起来，以致于ES E + P 并不影响这一平衡。而由ES到 产物生成这一步是反应的限速步骤。解离常数Ks的倒数可以作为酶对底 物的一种测量。 然而，应该指出，快速平衡法的基本假定有时不能成立，因为有的 反应 E + S ES是不成立的。后来，稳台法对这一点做了改进。 三. Brigg 和Haldane的工作 在H-M-M法中，假定 中的k-1k+2 ，这是一种特殊的限制。1925年 Brigg 和Haldane对-M- M法做了改进，他们在推导速度方程时把 k-1k+2这一假定取消了。他们 的方法就是现在大家熟知的稳态法或称为稳态近似。 在酶反应的过程中，中间产物ES一直稳定存在。ES的浓度变化可 用下式表示 dES/dt = k+1ES ( k-1 + k+2 )ES (1.1. 19),在反应刚开始时，我们可以近似地认为反应速度= k+2 ES 是不变的， 因为ES也不变。换句话说， dES/dt 与反应的总速度比较起来可以忽 略不计。 故有 dES/dt=0 则1.1. 19式变成 k+1ES ( k-1 + k+2 )ES = 0 （1.1.20) 这个式子代替了迅速平衡法中的1.1.15式(Ks=ES/ES)。 利用物种守恒 e0 = E0 = E + ES （1.1.21) 由（1.1.20) 和（1.1.21)式得到ES复合物表达式 （1.1.22) 将（1.1.22) 代入速度方程 = k+2 ES, 则 （1.1.23),在该法中唯一的假定是dES/dt = 0, 取消了快速平衡法中的两个假定 这意味着稳态法较快速平衡法优越。容易看出（1.1.18)式为（1.1.23) 式 的特例，即当k-1 k+2 时， （1.1.23) 式变成了（1.1.18)式。 第二节 酶反应动力学方法 一. 速度参数(Rate parameters) 由H-M-M 酶反应机制 导出的速度方程有下面的形式,快速平衡,限速步骤,(1.2.1),其中和是常数。 这个方程预示着： 1. 在底物浓度不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比； 2. 在底物浓度低时，s ，反应速度达到一常量e0 。 反应速度与酶浓度的关系，以及与底物浓度的关系如1.2.1和1.2.2所示，,Fig. 1.2.1 反应初速度与酶的 总浓度的关系,Fig.1.2.2 反应初速度与底物浓度 关系,如果定义两个变量x和y， x = + s y = e0 （1.2.2) 那么，(1.2.1)式可以变成如下形式， xy = e0 这是矩形双曲线，极值为 V = e0 与e0 呈正比。 常数为当= V时，所对应的底物浓度，成为Michaelis 常数， 用Km值表示。 = V/ e0 表示单位时间内一个酶分子可以转化的底物分 子数，称为分子活力（Molecular activity), 用k0 表示。 对于寡聚酶来说，常使用催化中心活力的术语，即单位时间内酶分 子中每个催化中心所能转化的底物分子数，用kcat（Catalytic center Activity) 表示。Kcat = k0 / n 。有时，把分子活力或催化中心活力叫转化 数（turnover number)。 这些在实验上可以测得的参数是进行动力学分析的基本常数，通常成 为速度参数或动力学常数，包括 Km, k0 (or kcat)。,现在，我们用Km , V, k0(or kcat)代替速度方程 中的和，那么速度方程有如下形式 （1.2.3) 对大多数酶反应来说，速度方程有如（1.2.3) 式的形式，但也有例外， 变构酶，反应速度对底物浓度关系为s型曲线，而非双曲线。 应该指出，在实验中测得的速度参数或动力学常数是表观的，它们 的真实物理意义并不清楚。仅当我们把经验的速 度方程（empirical Rate equation) 与由假定的机制推导的力学方程（mechanistic rate Equation)相比较时，这些参数如Km 和 k0（empirical constants)，它们 的物理意义才清楚：,empirical rate equation （1.1.18) 由快速平衡法推导的方程 （1.2.3) k0 = k=2 是ES复合物分解成产物的速度常数； Km = Ks是ES复合物解l离常数。 比较（1.1.18) 和（1.1.23)两式， empirical rate equation （1.1.18) 由稳态法推导的方程 （1.1.23),则 有所不同，不在是ES的解离常数。 因此，速度参数的物理意义不仅取决于反应机制，也取决于推导 速度方程的方法。换句话说，要说明速度参数的物理意义，必须知道 反应机制；反过来，速度参数也可以对了解反应机制提供某些线索。 例如，当我们把Km解释成ES的解离常数（Ks)时，并把k0看成ES 分解为产物的速度常数k+2，那么暗示，反应符合H-M-M机制， 而且，k+2 k-1。 二. 速度参数的测定 通过重排（1.1.18) 式,可以得到三种不同形式的速度方程，由实验数据可以求出Km 和Vmax 。 其中，涉及三种作图法，即 1. Lineweaver- Burk作图法（或双倒数作图法）； 2. Woolf 或Hofstee作图法; 3. Eadie作图法。 利用这些作图法可以检验实验数据与理论曲线（=Vs/(Km+s)的情况 （见Fig. 1.2.1)。,Fig. 1.2.1 三种作图法实验 数据与理论曲线拟合情况 Lineweaver- Burk作图法; (b) Woolf 或Hofstee作图法; (c) Eadie作图法。,各种作图法有各自的优缺点。不过，从统计学观点（点的分布）来看 S/对s图是三种作图法中最好的一种，但 人们已习惯用双倒数 作图法。 三. 进行酶反应动力学研究的基本程序和步骤 在文献中，已经发表了不少从各类酶反应机制推导出的速度方程， 但不少人可能不太熟悉推导这些方程的基本程序和步骤。 1. 推导速度方程的基本程序 首先，写出代表一个反应的机制的示意图 如 然后，由示意图出发推导速度方程。速度方程应包括物质浓度（ 如e0和s）和速度常数。在速度方程中，反应速度是对其产生影响的物 质浓度和速度常数的函数。 e0和s是实验中可测量的量。通常，在速度 方程中，不包括游离酶的浓度，因其在实验中不易测得到。,2. 影响酶反应速度的物质 （1）催化剂（酶），反应后复原； （2）底物和产物，经历化学变化； （3）效应剂，能与酶分子按计量结合，而又不发生任何化学变化 来影响反应速度。 3. 在文章中如何讨论酶反应机制 如果所提出的一种酶反应机制不能解释实验结果的话，那么可以说 所提出的反应机制是不正确的。另一方面，应该注意，即使由某一机制 推导的速度方程与实验上得到的数据相符，也不能肯定地说这一机制是 正确的。例如Henri 机制 I 尽管由它推导的速度方程在形式上与由Henri 机制 II推导出的一样，也不能说Henri 机制 I 是正确的。除非我们能够证 明没有任何其他机制可以解释实验数据，否则我们还是不能说，这个机 制就是正确的。在处理动力学文章中，常常看到如下说法“结果与机制相 符”，“结果与机制相符”，“ 结果可以根据这一机制来解释。” “ 解释 实验结果的最小可能机制是”等。,如上所说，解释某一反应机制的酶动力学的基本方法之一是研究底 物，酶和效应剂浓度对反应速度的影响。因此，浓度因子是影响酶反应 速度的因素之一。研究浓度的影响可以使我们check由假定的反应机制导 出的速度方程的可靠性，可以使我们examine假定的反应机制是否可以 解释由实验中测得的浓度对反应速度的影响，也可以使我们evaluate速 度参数。进一步由假定的机制赋予速度参数某种物理意义。考察抑制剂 或激活剂的浓度影响，可以确定它们的抑制或活化机制，计算酶-效应剂 复合物的解离常数。一般来说，人们也把抑制常数（ki)或活化常数（ka) 也称为速度参数。 4. 影响速度参数的因素 一般来说，速度参数（表观的）是指反应机制示意图中涉及的基本过 程速度常数的结合。因此，由浓度因素的研究得到的速度参数受下面两 个因素的影响： （1）外部的或环境的因素：温度、压力、介质的物理性质，如溶剂 的介电常数、离子强度和黏度等。,（2）内部结构因子：a. 底物与效应剂的分子结构；b.酶分子结 构， 包括化学结构、构象（受温度、压力、pH和变性剂的影响），和 物理状态（如，固定化）。 概括起来说，影响酶反应速度的因素有三类： 浓度因素； 外部因素（环境因素）； 内部因素（结构因素）。 5. 进行动力学研究的基本程序 下面的框图归纳了进行酶动力学研究的基本程序：,Fig. 1.2.2进行酶反应动力学研究的基本程序示意图,第三节 酶反应的稳态动力学和瞬变动力学 一. 酶反应的瞬变相 符合Henri-Michaelis-Menten机制的酶反应是最简单 的酶反应，可以用1.3.1式来表示， (1.3.1) 这是一个单底物，不可逆反应。,根据酶反应的稳态动力学近似，在酶反应过程中，中间产物ES复 合物一直稳定存在。ES的浓度变化速率可以用1.3.2式表示， 其中 = ES， e =E， s = S。在酶反应的稳态阶段，dx/dt = 0。 dx/dt = k+1es (k -1 + k+2) (1.3.2) 我们现在感兴趣的是在E和S混合后，达到稳态前的过程。为此必须 解出微分方程1.3.2 式，以便讨论ES复合物形成与分解的时间过程。 酶与底物物种守衡要求 e0 = e + （1.3.3） s0 = s + p (1.3.4) 产物的时间过程可以用下面的微分方程表示， dp/dt = k+2 （1.3.5） 由1.3.2式, 1.3.3-1.3.5式原则上至少可以得到表示e，s 和 p的时间过程表达式。,作为一种定性的讨论，我们做如下处理： 当底物浓度比酶浓度大过量时，即 e0e0 )，至少在反应刚开始时， ps, s是个常数，即 s s0。改写1.3.2式 d/dt = k+1（e0 -）s0 - （k -1 + k+2） （1.3.6） = k+1e0s0 - （k -1s0 + （k -1 + k+2） = a - k 其中， a = k+1e0s0 (1.3.7) k = k -1s0 +（k -1 + k+2） (1.3.8) 解出微分方程11.6式, = (a/k)(1 - e - k t ) (1.3.9) 1.3.9式表示ES复合物的时间过程, 如Fig.1.3.1所示。,Fig.1.3.1 酶-底物复合物ES的时间过程 曲线A代表S浓度不变的情况；曲线B代表真实情况,曲线A表示ES复合物从零时以一级反应（指数曲线）增加。当t 1/k (因为e-kt 1)时，ES增至平台值（a/k）。 在平台处，ES 的形成速度 f = k+1es，等于它的分解速度b =（k -1 + k+2）。此时， d/dt = 0， 这是ES的稳态。稳态前的那一相，可以近似为一级过程，称为预稳态。 曲线B表示反应的真实情况。在上述处理中，我们假定底物浓度在反应 过程中不变。,二. 产物形成的时间过程 对1.3.5式积分，得到P = t0 k+2dt。产物的时间过程示于Fig. 1.3.2中。图中的曲线A和B 分别代表当S=常数和S随时间减少的产物 时间过程。Fig.1.3.2中反应初相的迟滞部分相应于ES的预稳态。迟滞 相的出现反映了主要中间体ES复合物的形成，即在酶分子上发生的变化。,Fig. 1.3.2 产物P的时间过程,如果产物的形成不是经过ES复合物，而是经过E和S双分子碰撞，情 况会如何呢？我们从下述机制出发进行讨论， 产物的微分方程有如下形式， （1.3.12） 对1.3.12 式积分后得到的产物浓度时间关系用图1.3.3表示。从图中的曲 线可以看出，反应初相有一个“爆发”(曲线I )，而不是迟滞（曲线II）。原 因在于，根据这一机制，产物形成的最大速度应是E最大时，即反应刚 开始时，因而观察到一个“爆发”。 上述例子清楚地说明预稳态动力学如何可以区别导致相同稳态动力 学的不同机制。,Fig.1.3.3 产物在预稳态的时间过程与反应机制相关,三. 非稳态（Non-Steady-State) 如果Soe0 条件不成立，那么情况如何呢？Chance研究了过氧化 物酶的预稳态动力学。在e0和S0浓度数量级相同时，微分方程1.3.13 和1.3.14 dx/dt = k+1 e s ( k1 _+ k+2)x ( 1.3.13) dp/dt = k+2 x ( 1.3.14) 不能解析解出。这些方程的模拟解(analog)或数字解给出EX = x 和 p = p 的时间过程。,Fig. 1.3.4过氧化物酶催化的反应曲线(Stopped-flow),ES/uM,P/uM,很明显，由Fig. 1.3.4 看不到反映ES形成的平台。换句话说， ES稳 态不再明显出现。这种状态被称为非稳态。预稳态和非稳态通常称为酶 反应的瞬变相。 四. 瞬变相出现的时间范围 由 式= (a/k)(1 - e-kt)可以估计预稳态出现的时间。假如ES达