雌激素调控子宫内膜癌Ishikawa细胞中LRP16基因表达及其意义.doc

雌激素调控子宫内膜癌Ishikawa细胞中LRP16基因表达及其意义 作者：孟元光，韩为东，黄柯，伍志强，赵亚力，母义明，宋磊 【关键词】 LRP16基因；雌激素；Ishikawa细胞；EExpression regulation of LRP16 gene by 17estradiol and its significance in human endometrial cancer Ishikawa cells【Abstract】 AIM: To explore the regulation of LRP16 gene expression by 17estradiol (E2) in ERpositive human endometrial cancer Ishikawa cell line, and to investigate the effect of LRP16 overexpression on the proliferative potential and invasive growth of Ishikawa and the possible molecular mechanism. METHODS: The LRP16 mRNA level in Ishiwaka cells was determined by Northern blot analysis. The relative luciferase activity was measured using Dualluciferase reporter assay system. The effect of LRP16 overexpression on Ishiwaka proliferation was examined by the Trypan Blue exclusion method. The invasiveness of Ishikawa was evaluated by using the Matrigelcoated Transwell assay. The protein levels in Ishikawa were determined by Western blot analysis. In addition, the Ecadherin mRNA level was also examined by Nothern blot. RESULTS: 17E2 induced an increase in LRP16 mRNA levels in Ishikawa cells, whereas, its pure antagonist, ICI 182 780 reduced the LRP16 mRNA level. Ectopic ER transfection in Ishikawa increased the expression of LRP16 gene. The significant increase of the relative luciferase activity in Ishikawa cells cotransfected by pGL3S5 and ER plasmids was observed compared with that in the control cells transfected by pGL3S5 alone. Stimulative effect of LRP16 overexpression on the proliferation of Ishikawa cells was not observed in this study. Thirtypersent increase of the invasive capacity was observed in Ishikawa cells with LRP16 overexpression. The mRNA and protein levels of Ecadherin gene was nearly 3fold decreased in Ishikawa cells with the overexpression of LRP16, while the protein levels of MMP2, MMP9 and CD44 were not different between LRP16overexpressed Ishikawa cells and the control cells. CONCLUSION: Estrogen upregulated the LRP16 mRNA level by activation of ER and the LRP16 expression was dependent on the estrogen in ERpositive endometrial cancer cells. Upregulation of LRP16 did not promote the proliferation of the endometrial cancer cells, but increased its invasive potential possibly by suppressing the Ecadherin expression level.【Keywords】 LRP16; estrogen; Ishikawa; Ecadherin; endometrial carcinoma【摘要】 目的： 探讨子宫内膜癌Ishikawa细胞中雌激素（E2）对LRP16基因表达的调控作用，LRP16基因过表达对Ishikawa细胞增殖及侵袭生长能力的影响以及可能的分子机制. 方法： 采用Northern blot方法检测细胞中LRP16基因mRNA表达水平. 双荧光报告系统检测相对荧光素酶活性. 胎盘蓝死活细胞计数方法观察LRP16过表达对Ishikawa细胞增殖的影响，Matrigel包被的Transwell方法观察LRP16 过表达对Ishikawa细胞侵袭生长能力的影响. Western blot方法检测Ishikawa细胞中的蛋白水平. 结果： 雌二醇诱导了Ishikawa细胞中LRP16基因mRNA水平表达上调；而ICI 182 780则Ishikawa细胞中LRP16 mRNA水平下调. 增加ER表达量促使Ishikawa细胞中LRP16基因上调. pGL3S5与ER共转染Ishikawa细胞的相对荧光素酶活性较单纯pGL3S5转染组细胞升高30倍. 我们没有观察到LRP16基因过表达对Ishikawa细胞的促增殖效应. Transwell结果显示LRP16基因过表达Ishikawa细胞的侵袭率较对照组细胞增加了30%. LRP16基因过表达的Ishikawa细胞中E钙粘合素的mRNA以及蛋白水平较对照组细胞下调了3倍，而没有检测到MMP2，MMP9以及CD44蛋白水平的变化. 结论： 我结果表明E2通过激活ER上调子宫内膜癌Ishikawa细胞中LRP16基因mRNA水平，LRP16表达水平依赖于雌激素. LRP16基因表达上调没有促进子宫内膜癌细胞的增殖，但可能通过抑制E钙粘合素表达水平增加了细胞的侵袭能力.【关键词】 LRP16基因；雌激素；Ishikawa细胞；E钙粘合素；子宫内膜癌【中图号】 Q78；Q250引言既往研究结果证实LRP16是一个雌激素（E2）反应性基因，E2通过其受体（ER）上调LRP16基因的表达，LRP16基因过表达促进内源性ER阳性的乳腺癌MCF7细胞增殖，而抑制其表达则限制MCF7细胞的增殖，并且限制了MCF7细胞对E2的反应性增殖能力1-4. 我们在Ishikawa子宫内膜癌细胞中探讨了E2对LRP16基因的表达调控效应以及LRP16表达对E2活性的依赖性，并且研究了LRP16基因过表达对Ishikawa细胞增殖以及侵袭生长的影响，观察到LRP16基因表达依赖于E2活性，该基因过表达通过下调E钙粘合素（Ecadherin）促进Ishikawa细胞侵袭生长.1材料和方法1.1材料Matrigel胶、Ecardherin鼠抗人单抗购于美国BD公司，G418，24Transwell模型系统购于美国Coster公司、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、小牛血清白蛋白BSA以及17estradiol购于美国Sigma公司；DMEM培养液、胎牛血清（FCS）购于美国Hyclone公司；兔抗MMP2，MMP9，CD44，鼠抗Ecadherin以及actin抗体购于美国Sata Cruz公司；L15以及无酚红DMEM培养基购于协和医科大学基础所细胞中心；去除E2血清由我室自行制备；32PdCTP购自北京亚辉公司；探针标记试剂盒购自美国Promega公司；ER与LRP16真核表达载体由我室保存. ICI 182 780由军科院叶棋浓教授提供；Superfect转染试剂购自Qiagen公司； LRP16基因启动子（-676至-24 bp）驱动的荧光素酶报道子pGL3S5参见文献3.1.2细胞培养Ishikawa，T47D以及MDAMB231由我室保存，培养参照ATCC方法. 去除E2培养至少3 d.1.3细胞转染与细胞筛选10 cm培养皿培养Ishikawa细胞至覆盖率达50%，Superfect转染试剂转染LRP16真核表达载体pcDNA3.1LRP16或对照载体pcDNA3.1，转染方法参照说明书. 48 h后加G418（800 mg/L）筛选培养14 d，200 mg/L维持培养进行细胞学与分子学实验. Ishikawa细胞在转染ER后48 h提取总RNA进行Norhtern blot分析.1.4细胞增殖实验采用胎盘蓝死活细胞计数方法评估细胞增殖状况. 将G418筛选的Ishikawa细胞消化传至24孔板，每孔1104，每组3个平行孔. 每24 h计数，之前1PBS洗两次，胎盘蓝染色. 共计7 d. 该实验重复3次.1.5细胞侵袭实验4条件下解冻Matrigel过夜，双无DMEM按15稀释Matrigel，铺于Transwell小室上室，并置于37放置0.5 h使基底膜胶凝固. 每个小室接种1105个细胞，每组设3个平行皿，并加双无DMEM 200 L. 下室内加入350 mL 100 g/L FCS的培养基和Fibronectin (16 g/室). 继续培养24 h后，甲醇固定下小室细胞，HE染色，光学显微镜下(200)随机选取15个视野进行细胞记数，算出每个视野的平均值. 上述实验重复3次.1.6Northern blotTriZol提取总RNA，每个样品取20 g上样于12 g/L的甲醛变性凝胶，100 V电泳1.5 h，毛细管法将核酸转移至尼龙膜，80烤膜2 h. 杂交后的尼龙膜用4SSC/5 g/L SDS漂洗30 min，置-80放射自显影. 具体过程参见文献5.1.7Western blot40 g细胞总蛋白质上样于100 g/L的SDSPAGE胶电泳，转膜后分别与抗人MMP2（1400），MMP9（1400），CD44（1400），Ecadherin（1200）及actin（1500）孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗杂交，放射自显影.2结果2.1LRP16基因在Ishikawa细胞中的表达水平依赖于E2活性采用Northern blot方法分析了E2对Ishikawa细胞中LRP16表达水平的影响，结果如图1A所示，E2刺激了细胞中LRP16 mRNA表达水平的上调；为观察抑制ER活性对Ishikawa细胞中LRP16表达的影响，我们采用纯的雌激素抑制剂ICI 182 780培养细胞，观察到LRP16 mRNA水平显著下调（图1B），该结果表明E2刺激Ishikawa细胞中LRP16表达，而抑制E2活性则下调LRP16表达.为观察ER表达水平对LRP16表达的影响，我们将ER载体瞬时转染Ishikawa细胞，转染后48 h检测细胞中LRP16 mRNA表达量，结果如图1C示，外源性转染ER明显提高了Ishikawa细胞中ER的表达量，同时上调了LRP16基因的表达水平；为进一步验证ER是否通过对LRP16基因转激活上调其表达，我们采用不同剂量的ER表达载体与LRP16启动子驱动的荧光素酶报道子pGLS5共转染T47D, Ishikawa以及MDAMB231细胞，检测相对荧光素酶活性，结果如图1D示，随细胞中ER含量的增高LRP16启动子活性增强，这一结果明确证实ER具有刺激LRP16转激活效应，并且该效应依赖于ER的含量. 以上结果表明LRP16的转激活依赖于E2的活性.图1LRP16基因表达依赖于雌激素活性（略）2.2LRP16基因过表达促进了Ishikawa细胞的侵袭生长，但没有促进其增殖为检测LRP16基因过表达对Ishikawa细胞生物学效应的影响，我们筛选了LRP16过表达的Ishikawa细胞，首先进行细胞增殖实验，结果表明LRP16过表达没有显著刺激Ishikawa细胞的增殖（未显示结果）；接着我们采用改良的Transwell方法检测了LRP16过表达Ishikawa细胞的侵袭生长能力，结果如图2示， LRP16过表达ishikawa细胞穿过生物基底膜的数量比与对照细胞增多30%（P<0.05），表明LRP16过表达显著提高了Ishikawa细胞的侵袭能力.2.3LRP16基因过表达下调了Ishikawa细胞中Ecadherin的表达水平为进一步探讨LRP16促进Ishikawa细胞侵袭生长可能的分子学机制，我们采用Western blot方法检测了LRP16过表达与对照Ishikawa细胞中MMP2，MMP9，CD44以及Ecadherin基因的蛋白水平，结果显示LRP16过表达细胞中只有Ecadherin蛋白水平显著下调；进而我们采用Northern blot方法检测了两个细胞中Ecadherin基因mRNA水平的差异，结果显示LRP16过表达明显下调了Ishikawa细胞中Ecadherin基因的转录本（图3）.图2LRP16基因过表达促进了Ishikawa细胞的侵袭生长（略）图3LRP16过表达诱导了Ishikawa细胞中Ecadherin基因的mRNA与蛋白水平（略）3讨论子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，雌激素对正常子宫内膜的过度刺激以及雌激素受体的过度表达是导致子宫内癌发生与进展的主要因素，越来越多的研究资料证实雌激素通过其下游靶基因导致子宫内膜癌的发生与进展6，故识别新的雌激素靶基因并对其生物学功能进行研究对从分子水平研究子宫内膜癌有重要的科学意义与潜在的诊断治疗价值.LRP16是本研究组识别的一个雌激素反应性基因，既往研究证实雌激素通过其受体（ER）上调LRP16基因转录，该基因过表达促进内源性ER阳性的乳腺癌MCF7细胞增殖，分子机制涉及了G1/S期周期转换蛋白cyclin E与cyclin D1的表达上调1-2. 但LRP16在内源性ER阳性子宫内膜癌细胞中的研究目前尚不清楚. 本项目以子宫内膜癌Ishikawa为模式细胞，重点探讨LRP16对雌激素的反应性以及LRP16过表达对细胞生物学行为的影响及其可能的分子学机制. 结果显示雌激素刺激LRP16基因在Ishikawa细胞中的表达，而抑制雌激素活性下调了LRP16基因表达，表明LRP16表达对雌激素活性的依赖性，进一步证实LRP16是一个雌激素反应性靶基因，同时证明LRP16表达水平可以反映雌激素的活性状态以及雌激素信号通路的活跃程度.子宫内膜癌的侵袭生长是瘤细胞重要的恶性表征，其分子学机制主要涉及了MMP2，MMP9，CD44以及Ecadherin的表达下调7-9. 我们观察到LRP16过表达显著增加了Ishikawa细胞的体外侵袭生长能力，分子学研究结果显示LRP16过表达下调了Ecadherin基因的表达，初步表明LRP16促进Ishikawa细胞侵袭生长的分子机制主要涉及了Ecadherin表达水平的变化.总之，通过本项目研究我们认识到雌激素调控的靶基因LRP16在子宫内膜的发生与进展中可能有重要作用，进一步的临床病理学研究结果将充分证实这一论点.【参考文献】1 Han WD, Mu YM, Lu XC, et al. Upregulation of LRP16 mRNA by 17estradiol through activation of estrogen receptor (ER), but not estrogen receptor (ER), and promotes human breast cancer MCF7 cell proliferation: A preliminary reportJ. Endoc Relat Cancer, 2003, 10(3):215-222.2 韩为东，李琦，赵亚力, 等. 小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF7乳腺癌细胞增殖J. 中国生物化学与分子生物学报, 2005, 21(1):113-119.3 Zhao YL, Han WD, Li Q, et al. Mechanism of transcriptional regulation of LRP16 gene expression by 17 estradiol in MCF7 human breast cancer cellsJ. J Mol Endocrinol， 2005, 34(1):77-89.4 赵亚力, 韩为东, 母义明,等. 雌激素通过ER与Sp1的相互作用上调LRP16基因的转录J. 中国生物化学与分子生物学, 2004, 20(3):99-105.5 Xu Q, Konta T, Furusu A, Nakayama K, et al. Transcriptional induction of mitogenactivated protein kinase phosphat