实验室的标准操作规程S.ppt

实验室的标准操作规程（SOP）,水产品和畜、禽肉中氯霉素残留量检验方法 气相色谱法-质谱检测法 1 方法提要 根据方法进行验证修改后,并依据欧盟指令建立了质谱测定条件，将某些关键步骤进行细化。 本方法适用于水产品和畜、禽肉组织、肠衣中氯霉素残留确证检测。用乙酸乙酯提取，提取液用正己烷净化，硅烷化后用气相色谱配有负化学源的5973N质谱检测器检测。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,2 实验室设备 2.1 仪器和设备 2.1.1 Agilent6890气相色谱仪：配有负化学源的5973N质谱检测器。 2.1.2 离心机：5810型，Eppendorf公司。 2.1.3 均质器：T25型，18G 刀，IKA公司 2.1.4 旋转蒸发器：R-200，BUCHI公司。 2.1.5 移液枪：200L、1000L、5000L，Eppendorf公司。 2.1.6 具塞塑料离心管：15 mL 、50 ML。 2.1.7 涡流混匀器：39760型，Thermolyne公司。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,2.2 试剂 所有试剂均为分析纯级（有机试剂需重蒸馏），水为去离子水。 2.2.1 乙酸乙酯。 2.2.2 甲醇。 2.2.3 正己烷。 2.2.4 氯化钠。 2.2.5 无水硫酸钠：经650灼烧4 h，置于干燥器内备用。 2.2.6 硅烷化试剂： Sylon BFT 99% N,O-双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）美国 Supelco产品，货号33154-u，0.1mL/ampul。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,2.3 标准物质 2.3.1 氯霉素（chloramphenicol）：纯度99%，Amresco分装，上海生工生物工程有限公司和Sigma公司。 2.4 标准溶液的配制 2.4.1 标准储备液的配制 准确称取氯霉素标样50mg置50ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，混匀，浓度为1 mg/mL，4保存6个月。 2.4.2 标准工作溶液配制： 取1mL储备液用甲醇溶解定容到100Ml，此时浓度为1g/mL，取1g/mL 1mL定容至10mL，浓度为0.1g/mL；取1g/mL 0.5 mL定容至10mL，浓度为0.05g/mL。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,3 实验方法 3.1 试样制备 从所取原始样品中取出部分有代表性样品，经充分混匀。用四分法缩分出不少于500 g试样，混匀，均分成两份。装入清洁容器内，加封后，表明标记。 3.2 测定步骤 3.2.1 提取与净化 称取5 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中。加入25 mL乙酸乙酯，用均质器均质提取2 min，4000 r/min离心3 min。将乙酸乙酯层移入50 mL鸡心瓶中，试样再加入5 mL乙酸乙酯，涡流混匀器混匀1min，合并乙酸乙酯提取液，于40旋转蒸发至近干。 加入1 mL甲醇溶解残渣，再加入20 mL 4% 氯化钠溶液和15 mL正己烷，用涡流混匀器混合1 min，4000 r/min离心3 min。弃去正己烷层，水层加15 mL正己烷，同上操作，弃去正己烷层。水层中加入15 mL乙酸乙酯，用涡流混匀器混合2 min，3000 r/min离心3min。吸取乙酸乙酯层，通过无水硫酸钠柱（5g）脱水于另一个50 mL鸡心瓶中，用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱。于40 旋转蒸发至约1 mL。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,3.2.2 衍生化 将浓缩液移入5 mL离心管中，用1 mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯。于40吹氮气蒸发至干。加入100 L正己烷和100 L硅烷化试剂，于70烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液（6：4），混匀溶解，供气相色谱测定。 3.2.3 测定 3.2.3.1 气相色谱条件 a) 色谱柱：30 m 0.25 mm 0.25 m，HP-5MS； c) PTV进样口温度：70(1.0 min)700/min 250(6.0 min) 700/min 300； d) 载气：氦气，恒压模式，柱头压 10psi； e) 进样量：2uL,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,3.2.3.2 质谱条件 a) 传输线温度：280C b) 溶剂延迟： 5min c) 离子源温度：150C d) 四极杆温度：100C e) 反应气：甲烷，流量：2ml/min f) 选择离子监测 目标物 监测离子 氯霉素 466，468，470，376 其中定量离子为466，定性离子为468，470，376 g) 离子停留时间：60毫秒,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,3.2.3.3 标准溶液的衍生化 取适量标准溶液，用氮气吹干，加入200 L正己烷和100 L硅烷化试剂，于80烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液（6:4），混匀溶解，供气相色谱-质谱测定。在上述色谱条件下：氯霉素保留时间为 11.65 min。 3.2.3.4 样品测定 分别注射等体积的标准工作液、试剂空白、阴性控制样品、待检样品（不超过10个）、阴性控制和阳性控制样品，按上述色谱条件测定，峰面积定量。 4、气相色谱-质谱定性 (1)保留时间定性：在上述条件下,目标化合物的保留时间为11.650.1min,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,(2)质谱确证 在保留时间窗口内出现色谱峰后，获取其质谱图，扣除本底后如果以下判别标准全部符合，则可判定氯霉素存在： 所有4个监测离子全部在质谱图中出现 离子466为基峰和定量离子，其它3个离子与基峰丰度之比应符合如下标准 质荷比 标准丰度比（%） 允许相对偏离范围（%） 468 76 20 470 18 30 376 20 25,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,5、质量控制 每组实验除标准、样品，需同时进行溶剂空白实验、阴性控制样品实验和阳性控制样品实验。 5.1 溶剂空白 不加试样，用与样品相同的方法进行处理。 5.2 阴性控制样品 称取5.0克阴性控制样品，置于50 mL离心管中，用与样品相同的方法进行处理。 5.3 阳性控制样品 称取5.0克阴性控制样品，置于50 mL离心管中，用微量注射器加入0.1g/mL的氯霉素标准工作液25 L，相当于样品浓度0.5ng/g用与样品相同的方法进行处理。用相同浓度的标准进行定量，计算回收率，用来判断本组操作的可靠性。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,6 结果计算 6.1 外标法定量 用色谱数据处理机或按下列公式计算： 式中：X 试样中氯霉素药物残留含量，mg/kg； A 样液中硅烷化氯霉素色谱峰面积； AS标准工作溶液中硅烷化氯霉素色谱峰面积； c 标准工作溶液中氯霉素的浓度，g/mL； V 最终样液的定容体积，mL； m 最终样液所代表试样量，g。 计算结果需扣除空白值。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,7 测定低限 本方法氯霉素的测定低限为 0.2 g/kg. 8 可接受的检验结果 在添加浓度0.5g/kg时，回收率，50%120%。 9 检测报告 按照SPSBA00024检验报告管理程序执行。 10 方法验证 10.1 取相当于1g/g的氯霉素衍生化物，在200-600M/z范围，进行全扫描分析，确定定量离了和确证离子及其丰度比，见附录1。,实验室的标准操作规程（SOP） 气相色谱法-质谱检测法检测氯霉素,10.2 标准工作曲线 用注射器分别移取0.05g/mL ，20L 、30L、60L；0.1g/mL，50L, 1g/mL, 25L、标准工作液置于6个5ML 离心管中，氮气吹干，其系列分别相当于样品中0.2、0.3、0.4、1、5 ng/g的浓度。 分别注射等体积的标准工作液按给定的色谱条件进行测定，用GC-NCI