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乳腺癌基因治疗进展【摘要】 基因治疗的方式有两类 ：（1）基因矫正和置换；（2）基因增补。目前研究的基因治疗方法主要有免疫基因治疗、癌基因拮抗治疗、化学基因治疗（多药耐药基因治疗和自杀基因治疗）、抗肿瘤血管形成基因治疗、使用溶瘤病毒的治疗等措施。目前还没有一种基因治疗可代替常规疗法, 基因治疗与常规疗法相结合, 是乳腺癌治疗的发展趋势。随着乳腺癌发病机制的深入研究, 乳腺癌相关基因的不断发现, 乳腺癌基因治疗将取得更多突破, 为临床治疗提供新的途径。 【关键词】 乳腺癌;免疫基因治疗；癌基因拮抗治疗；化学基因治疗；抗肿瘤血管生成基因治疗 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。目前乳腺癌的常用治疗手段主要是以传统的手术治疗为主，术后辅以局部或全身的放疗、化疗及内分泌治疗。这些手段虽然可以使患者获得较高的生存率甚至治愈，但术后复发及远处转移的问题仍然是困扰医学界的一大难题。随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展和人类对乳腺癌发病机制认识的不断深入，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分。基因治疗在乳腺癌的治疗中显示出良好的应用价值，并且取得了一定的效果，将日渐成为一项有前景的治疗选择。 1 免疫基因治疗 1.1 细胞因子治疗 细胞因子调节多种细胞生理功能，是机体防御和清除肿瘤的重要因子。肿瘤的发生与肿瘤患者的细胞因子表达有关，因此, 通过细胞因子网络增强机体抗肿瘤免疫达到清除肿瘤的目的，一直是该领域研究的一个热点。（1）将细胞因子基因导入肿瘤细胞。Pastorakova 等1 将表达人源性肿瘤坏死因子（hTNF-）基因的质粒体外转染不同的乳腺癌细胞株（MDA-MB-361、HCT116、8-M G-BA）。检测结果表明hTNF-在3种细胞株中均有表达, 可显著诱导MDA-MB-361 凋亡、坏死，对HCT116 作用则较弱，而对8-M G-BA 几乎无作用。动物实验表明hTNF-可在裸鼠体内引起MDA-MB-361 坏 死。Loudon 等2研究发现 DISC-hGMCSF 能够高效转染人乳腺癌细胞，分泌GM-CSF;DISC-hGMCSF、在4T1 中可有效抑制肿瘤生长，与化疗药物联合使用时效果不受影响；（2）将细胞因子受体基因导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞表面相应的细胞因子受体表达增多，从而将大大增强细胞因子的抗肿瘤效果。乳腺癌细胞表面表达 IL-13 受体2（IL-13R2） 后, 可提高其对 IL-13 的敏感性。Kawakami等3将载有 IL-13R2 的质粒皮下注入乳腺癌荷瘤小鼠体内，再在鞘内注射 IL-13 进行干预，取得了显著的抗瘤效果，且对动物其它重要脏器无影响。病理结果显示，消退的瘤体内有大面积的组织坏死, 伴有巨噬细胞和NK 细胞的浸润。以IL-13 对肿瘤的直接毒性作用和相关免疫反应的激活有关。 1.2 将癌特异抗原基因导入抗原提呈细胞 BA46是乳腺癌相关抗原，存在于多数乳腺癌细胞膜表面,但造血细胞表面无此抗原。自身抗原不能刺激机体产生CTL 反应。Liu 等4将载有BA46 基因的重组腺相关病毒载体转染树突状细胞，实验结果表明树突状细胞可表达BA46 抗原；树突状细胞 基因组整合AAV/BA46/Neo 载体；可刺激机体产生强烈、迅速的BA46 抗原特异性、MHC-I限制性CTL 反应，但仅持续1周的时间；产生 IFN-T 细胞数量显著增多而产生白细胞介素-4T 细胞数量较低；树突状细胞高表达CD80 和CD86。Chen等5将带有ErbB22neu 基因的腺病毒载体(AdNeuTK)转染树突状细胞，小鼠动物实验发现，经ErbB-2/neu 基因修饰的树突状细胞疫苗能诱导抗肿瘤免疫反应，与Adm白细胞介素-12 联合应用抗肿瘤效果则更好。 1.3 肿瘤疫苗治疗 目前应用于临床试验的肿瘤疫苗治疗有以下2种：（1）全肿瘤细胞疫苗 即采用转基因手段促进机体对肿瘤细胞的免疫反应。将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细胞内 。或在体外将这些基因转染到肿瘤细胞内，在肿瘤细胞经放射线照射灭活后自身移植于体内，以增强免疫反应。目前用于该方面研究的免疫增强细胞因子包括白细胞介素- 2，白细胞介素-12，干扰素、粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM - CSF)等；（2）树突状细胞为基础的肿瘤疫苗 具有强烈抗原提呈功能的树突状细胞也是免疫治疗的靶目标，能够有效地将肿瘤抗原提呈传递给CD4+和CD8+细胞，活化特异的 CTLs。 2 癌基因拮抗治疗 2.1 转染抑癌基因 抑癌基因是指正常细胞内存在的、能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前已分离克隆的抑癌基因主要有p53、Rb、ERBA、WT1、DCC、MCC、APC、nm23、MTS、TIMP、FHIT、BRCA1和 BRCA2等。而以p53、FHIT、BRCA1和BRCA2等实验研究较多。现在常用的方法是以腺病毒为载体，将相应的抑癌基因转染乳腺癌细胞，抑制乳腺癌细胞的生长。p53基因是研究较为深入的一种，野生型可直接抑制DNA复制，使细胞出现G1期阻滞可调控细胞凋亡。乳腺癌患者中有 40%出现p53基因的缺失或突变。将野生型p53基因导入p53基因缺失或变异的乳腺癌细胞，可抑制肿瘤细胞的生长 ,促使肿瘤细胞凋亡。在家族性乳腺癌中发现的与其发病相关的抑癌基因 BRCA1常存在突变 ,在大多数散发性乳腺癌中表达往往过低。这一发现为将野生型BRCA1导入乳腺癌细胞，恢复BRCA1功能的基因修复治疗乳腺癌奠定了理论基础。目前有在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体 ,瘤内直接注射的方法，将 BRCA1用于晚期乳腺癌胸壁转移瘤的治疗6。 Fragile histidine triad（FHIT）基因定位于染色体 3p14.2，是一种新发现的抑癌基因。FHIT基因的大片段缺失常存在于包括乳腺癌在内的许多肿瘤中。Sewgnani等7研究表明用腺病毒转染 FHIT（Ad-FHIT）后，可激活 caspase-2并释放细胞色素 2，最终导致乳腺癌细胞凋亡。 2.2 抑制癌基因的治疗 抑制癌基因功能是通过各种手段消除异常活化的癌基因的作用，达到治疗肿瘤的目的。目前常用的主要有 3种方法：（1）反义寡核苷酸（ODNS）或RNA干扰技术阻止癌基因 mRNA转录和翻译。许多与乳腺癌有关的癌基因可受反义 ODNS的有效靶击。实验证实反义ODNS能显著下调乳腺癌细胞 c-erbB-2 mRNA表达 ,抑制癌细胞增生。Osta等8报道上皮细胞黏附分子（EpCAM）siRNA能使 EpCAM发生基因沉默现象，导致乳腺癌细胞系增殖率下降 35%80%。同时还可使乳腺癌细胞系 MDA2MB2231的细胞迁移减少 91.8%，细胞浸润减少 96.4% 。如果直接将这些体外合成的 siRNA导入哺乳动物细胞内，仅会引起 47天的基因沉默，不足以持续影响细胞生理功能。肿瘤的基因治疗需要一个能稳定而持久地产生 siRNA的体系来维持这种抑制蛋白合成的效果。Brummelkamp等9构建了一个载体系统 pSUPER，它使用 RNA聚合酶 Hl-RNA 基因启动子，将siRNA相应的正义链和反义链整合到启动子下游处，两序列间隔 5个碱基。导入哺乳动物细胞后，利用 RNA聚合酶转录大量的单链 RNA，再折返形成 19bp的双链 siRNA。由于这些 siRNA的一端存在发夹结构，故称为短发夹 RNA （short hairpin RNAs, shRNAs）。同样这些被转染的哺乳动物细胞出现了持久而稳定的特异性蛋白合成的抑制，并出现了相应的表型。研究表明shRNAs的干扰效果优于 siRNA的干扰效果，可根据其启动子的特点而选择不同长度的shRNAs，抑制乳腺癌细胞端粒酶的合成，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，为乳腺癌的基因治疗开辟了一条新途径10；（2）以显性负突变体干扰肿瘤细胞内信号转导。Lee等11在雌激素受体+乳腺癌细胞中转入雌激素受体显性负突变体后也能显著抑制肿瘤细胞生长；（3）使癌基因蛋白不能到达正确的细胞内位置，即用细胞内抗体竞争性结合细胞内位点和生长因子受体。 3 化学基因治疗 3.1 多药耐药基因治疗 多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生耐药同时也对其他结构和作用机制不同的药物获得耐药。肿瘤细胞的多药耐药性及大剂量化疗的严重骨髓抑制是现阶段临床上化疗失败的主要原因。目前已分离了两种多药耐药基因: MDR1、MDR3，其中MDR1与肿瘤细胞典型多药耐药有关。它仅有一个开放性阅读框架，可编码 1280 个氨基酸的高度糖基化的跨膜蛋白P-糖蛋白（P-gp），其中分子量为 170 103，故又称为p170。Taka-hashi等12在乳腺癌的MDR1基因治疗临床研究中发现，进展期乳腺癌和复发性乳腺癌患者行大剂量化疗的同时，移植已转入 MDR1基因的自体同源外周干细胞,而后再用多西他奇化疗，能明显抑制肿瘤生长改善预后，无其他明显的不良反应。在美国对高剂量化疗合并自体造血干细胞移植的肿瘤患者，也已开始耐药基因的临床试验。 3.2 自杀基因疗法 自杀基因疗法的机制有：（1）直接杀伤作用 即转染了前药转换酶基因的肿瘤细胞能将前药转变成细胞毒物质，从而直接杀伤肿瘤细胞；（2）旁观者效应（bystander effect）转染了自杀基因的肿瘤细胞被杀死，其周围大量未被转染的细胞也被杀死的现象称为旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用。由于基因载体系统在体内的转染效率很低，自杀基因在体内对肿瘤直接杀伤作用比较小，因而旁观者效应起着十分重要的作用。 目前用于乳腺癌治疗的自杀基因体系主要有以下几种：（1）单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)基因/更昔洛韦(GCV)系统 GCV 是阿昔洛韦的衍生物，在HSV-TK 的作用下转化为单磷酸GCV ,继而在哺乳类动物细胞激酶的共同催化下转化为细胞毒物质三磷酸 GCV。它可与 三磷酸核苷竞争 DNA 多聚酶的结合位点，阻止单链 DNA 的延长，使细胞周期停滞在S期，抑制细胞分裂；（2）大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因/5-氟胞嘧啶系统 胞嘧啶脱氨基酶仅存在于细菌或真菌中，哺乳类动物细胞缺乏这种酶。该酶可使5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶，继而形成单磷酸5-氟脱氧尿苷。它是一种不可逆的胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂，使脱氧核苷三磷酸合成受阻从而抑制DNA 的合成；（3）水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)基因/5-(2-溴乙烯)-2-脱氧尿苷（BVDU)系统 Grignet-Debrus 等的实验表明，VZV-TK可作为一个自杀基因，但要以BVDU作为前药。BVDU 三磷酸盐可结合到DNA链中，诱导单链断开。但BVDU 活化后的主要细胞毒性在于阻止细胞内胸核苷酸的合成，使脱氧尿苷（dUMP）转化成脱氧胸苷（dTMP）13；（4）suface-tethered bacterial CPG2stCPG2(Q)3基因/4-(2-chloroethyl)、 CMDA系统 CPG2能将CMDA水解产生苯甲酸苯酚和苯胺氮芥，或能过自溶反应产生蒽环类抗肿瘤药，它的最大优点是产生的细胞毒物质为细胞周期非特异性药物。免疫组化试验显示，即使在仅含有很小一部分stCPG2(Q)3表达的细胞中，在前药 CMDA 治疗下大部分细胞凋亡，提示存在着巨大的旁观者效应14。 4 抗肿瘤血管生成基因治疗 基因治疗用于抗肿瘤血管生成是另一个新的治疗措施。其机制是基于肿瘤和正常内皮细胞之间基因表达的差异，因而选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基因的表达，抑制肿瘤血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的。抗血管生成因子包括内皮抑素、血管抑素和干扰素-均为目前研究的目标。Gyorffy等15分别使用鼠源性血管抑素和白细胞介素-12瘤内注射治疗乳腺癌动物模型，结果Ad-白细胞介素-12引起 20%肿瘤退化，13%肿瘤完全消失。二者联合注射使 96%的肿瘤退化，54%完全消失，并且提高了动物对再次接种的肿瘤细胞的免疫力。目前所知最强的是血管生长因子（VEGF），人们正致力于拮抗血管生长因子/血管生长因子受体 抗血管生成的研究。反义核酸、可溶性血管生长因子受体、核糖酶、抗血管生长因子单克隆抗体和受体酪氨酸激酶抑制剂已经被用于抗肿瘤血管生成的基因治疗。 5 应用溶瘤病毒的治疗 溶瘤病毒不是靠携带外源基因转染肿瘤细胞杀伤肿瘤细胞，而是通过直接感染肿瘤细胞后“溶解”肿瘤细胞。常见的溶瘤病毒包括突变的腺病毒 ONYX-015(dl1520) 、HSV-1 突变体G207、人类逆转录病毒 3、水泡性口炎病毒(VSV)和 EB 病毒等。为了提高溶瘤毒素的靶向性，人们将组织和肿瘤特异性启动子插入溶瘤病毒的基因组以控制基因表达。Hernandez 等16将对低氧和雌激素反应的双特异启动子插入人类腺病毒5型基因组的E1A 和E4 区， 利用该系统构建了AdEHT2 和AdEHE2F，从而杀死低氧条件和雌激素受体阳性的乳腺癌细胞。同理，因端粒反转录酶和E2F-1启动子在肿瘤细胞中常被激活，将其分别插入AdEHT2和AdEHE2F的E4 区，能杀伤肿瘤细胞。 6 其它抗癌基因治疗策略 近年来多种其它基因也被成功地用于基因治疗的实验研究中。如:应用血管生长因子反义寡核苷酸显著抑制人乳腺癌细胞株产生血管生长因子，进而抑制肿瘤新生血管形成达到抑制肿瘤生长与转移；将携带内皮他丁和血管他丁的脂质体转入乳腺癌细胞后使细胞成瘤性大为下降；将凋亡相关基因（如 Fas 基因或白介素-1转换酶基因 E）导入肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞发生凋亡等 17。 7 展望与乳腺癌基因治疗存在的的问题 乳腺癌的基因治疗是一种很有前景的生物治疗手段，目前已有一些研究成果应用于临床，并取得了显著的疗效。Herceptin (荷塞停)是一抗人乳腺癌HER2 单克隆抗体, 该药物可单独或与紫杉醇联合用于转移性乳腺癌的治疗。美国食品及药物管理局 (FDA)于1998 年10 月正式批准将一株抗p185人源化抗体Trastuzum ab (商 品 名 Herceptin，Genentech/罗氏公司)用于临床治疗p185 erbB2高表达的转移性乳腺癌。它是一种以肿瘤特异性为治疗靶点的药物, 也为人源化抗体治疗癌症带来了新曙光。 目前，乳腺癌基因治疗尚存在以下问题：（1）用于研究和临床的基因转染方法有多种，但转染效果仍不令人满意。目前看来较有希望用于临床的是以逆转录病毒和腺病毒为载体的转染法。逆转录病毒转染率较高且表达稳定，但它仅对增殖活跃的细胞才有较高的转染率，且在转染过程中可整合到宿主细胞而发生插入型突变和癌基因激活，不适于介导人体内基因的转移。腺病毒所携带的基因不整合到宿主细胞的染色体上，且具有较高的转染率但表达不够稳定；（2）缺乏特异性和高效性载体18若仅部分肿瘤细胞被导入基因，治疗效果会受到影响，而载体特异性差则会导致癌旁组织及骨髓等其他重要组织被累及。载体系统选择 需考虑病毒载体的潜在致瘤性、转染的有效性等问题。因此，为加强基因治疗的靶向性、安全性, 开发出高效的新的载体系统已成为该领域研究热点；（3）容易复发 旁观者效应虽有助于进一步杀死肿瘤细胞，但其又有选择性及局部区域性。不能保证所有肿瘤细胞都能被杀死，经丙氧鸟苷治疗，肿瘤消退后停药，则肿瘤又迅速复发；（4）寻找更为有效的目的基因；（5）基因治疗及与其它治疗方法联合应用有待完善。【参考文献】 1 Pastorakova A, Hlubinova K, Bodo J, et al. 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