假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染.doc

假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染 作者：裴斐，何蕊，李俊彦，余红【摘要】 目的 构建假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG，并用于转染兔平滑肌细胞，为兔平滑肌细胞基因转染寻找一种高效的载体。方法 构建含有报道基因lacZ的假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG，测定滴度，并转染兔平滑肌细胞，观察其转导效率。并与MuLV的转导效率进行比较。结果 构建的MuLV/VSVG载体，病毒滴度为67.8106CFU，转染兔平滑肌细胞的效率是(9212)%。而MuLV的转导效率为(245)%。结论 成功构建了假型逆转录病毒载体MuLV/VSVG载体，该载体作为一种高效的载体可用于兔平滑肌细胞基因转染。 【关键词】 假型逆转录病毒载体；平滑肌细胞；转染ABSTRACT: Objective To construct pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG and transfer it into rabbit smooth muscle cells (SMC) in order to provide a highefficiency vector for SMC gene transfer. Methods We constructed pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG containing the previously reported gene lacZ, determined the titer, and determined the efficiency of gene transfer into SMC mediated by pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG. Finally the transfer efficiency was compared with that by MuLV. Results MuLV/VSVG vector was constructed. The titer of the vector was 6-7.8106CFU, the transfer efficiency was (9212)% by using MuLV/VSVG vector and (245)% by MuLV vector. Conclusion Pseudotyped retroviral vector MuLV/VSVG which was constructed successfully is a kind of highefficiency gene transfer vector in smooth muscle cells.KEY WORDS: pseudotyped retroviral vector; smooth muscle cell; gene transfer基因治疗是指将具有防治潜能的外源基因，通过相应的载体转移到患者的有关组织器官和细胞内，获得适当的表达达到防治和减轻疾病的目的。其中目的基因载体的选择是基因治疗的关键之一。逆转录病毒是较常用的一种病毒载体。鼠白血病病毒MuLV衍生的逆转录病毒载体被广泛应用于将基因转染到哺乳细胞中并长期表达1。但该载体稳定性差，产生的病毒滴度低，转染到人类细胞效率低，并且只能转染分裂期细胞。VSVG，疱疹性口炎蛋白VSV的包膜蛋白，是一种单链蛋白，可以完全替代MuLV的env蛋白，产生基于MuLV的高转染率的病毒载体MuLV/VSVG，已经被用来构建假型MuLV/VSVG以提高MuLV载体的稳定性及转染效率2。本研究用兔平滑肌细胞作为靶细胞，观察MuLV/VSVG的转导效率，并与MuLV的转导效率进行比较，探讨MuLV/VSVG用于平滑肌细胞基因转染的可行性。1 材料与方法1.1 实验动物、试剂和仪器一月龄新西兰兔；小鼠成纤维细胞NIH3T3(美国迈阿密大学外科实验室)；DMEM培养基(Hyclone公司)；小牛血清(杭州四季青生物技术材料研究所)；胰蛋白酶(Sigma公司)；多聚季胺(polybrene)储用液(8g/L)(Sigma公司)；G418储用液(50g/L)(GIBCO/BRL)；CO2培养箱、无菌超净台、离心机、倒置显微镜。1.2 细胞株和质粒人293T细胞、293/GPG包装细胞系由余红博士馈赠；pCnBgSN3是lacZ基因的表达质粒；质粒pHIT604是鼠白血病逆转录病毒(murineleukemia retrovirus, MuLV)Gag和Pol蛋白的表达质粒；质粒pCVG2是疱疹性口炎病毒G糖蛋白(vesicular stomatitis virus G glycoprotein, VSVG)的表达质粒。所有质粒由美国迈阿密大学外科实验室余红博士提供。所有质粒DNA均用大肠杆菌DH5感受态细胞(TIANGEN BIOTECH)扩增，并用试剂盒(Valencia, CA)从大肠杆菌中提取。1.3 方法1.3.1 SMC的分离培养一月龄大耳白兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后，在无菌条件下，迅速将颈内静脉取出，盛入有PBS液的平皿中。洗净血块，剥除外膜，将血管翻转内膜面朝外，用刀片自上而下刮12遍，去除VEC。然后用显微镊撕下血管中膜的平滑肌层，将其剪碎(0.51mm3)，接种于培养瓶中，在CO2培养箱中放置2.53.0h，使组织块较牢固地黏附于瓶壁，加入含200mL/L新生牛血清的DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM, Gibco)培养液，34d更换培养液一次。细胞生长形成致密单层时，用1.25g/L胰蛋白酶消化，按12比例传代培养，56d可继续传代一次5。实验采用第24代细胞进行研究。1.3.2 小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的培养含100mL/L灭活胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)，2mmol/L谷氨酰胺，100mg/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养液，置37，50mL/L CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养，隔天半量换液，细胞为对数生长期，存活细胞百分率95%(台盼蓝拒染法)，备用。1.3.3 两型逆转录病毒的生产MuLV及MuLV/VSVG载体均参考三个质粒短暂转染体系3方法生产，二者均含有2半乳糖苷酶报道基因。293T/17细胞(美国迈阿密外科基因实验室冻存，1106个细胞/10cm直径培养皿)。采用改良磷酸钙沉淀转染法。MuLV加入质粒DNA pCnBgSN，pHIT60和pCAE各10g；MuLV/VSVG则加入质粒pCnBgSN，pHIT60和pCVG各10g，转染16h后将细胞培养液更换为含有10mmol/L sodium butyrate(Sigma)的培养基，12h后，以6mL新鲜培养基替换原培养基，以生产病毒，培养12h后，收获含有病毒颗粒的上清，0.4m的滤器过滤后分装，-70保存，备病毒滴度测定及转导。1.3.4 VSVG/MuLV浓度的测定采用G418克隆筛选法6：第1天，将NIH3T3细胞放入30mm的六孔板中(5104细胞/孔)；第2天，将病毒上清液与多聚季胺混存(终浓度为8mg/L)，滴度测定时以含有多聚季胺的DMEM培养液以110梯度稀释上清，循六孔板以16孔序号形成10-110-6个稀释浓度；第3天，以3mL含0.8g/L G418的DMEM培养液用作G418选择测试；G418筛选，细胞以含0.8g/L G418的培养液培养7d后，弃去培养液，细胞以100mL/L甲醛固定后用PBS洗涤3遍，培养皿中的细胞以1mL含10g/L美蓝的甲醛染色5min后用自来水冲洗，对未被洗去颜色的细胞以克隆为单位进行计数。病毒滴度即为染色细胞克隆的数目(稀释系数/所加病毒的体积)。1.3.5 假型逆转录病毒载体转导SMC 第1天将SMC以3104个/孔接种于直径为30mm的6孔板中；第2天SMC生长至约70%80%融合后，加病毒上清0.5mL(含8mg/L多聚季胺)孵育2h后添加2mL新鲜培养基，培养后行Xgal染色。2 结果2.1 SMC鉴定VSMC行抗肌动蛋白SABC法免疫组织化学染色鉴定。组织化学染色呈阳性，在细胞胞浆内可见细胞的肌丝被染成棕黄色(图1)。2.2 滴度检测结果每毫升含重组病毒MuLV颗粒上清液的滴度为56.2105集落形成单位(CFU)，每毫升含重组病毒MuLV/VSVG颗粒上清液的滴度为67.8106CFU。疱疹性口炎病毒G糖蛋白修饰的MuLV/VSVG转染293T/17细胞，比单用MuLV所生产病毒的滴度有明显提高(P<0.05)。2.3 假型逆转录病毒载体转导SMC鉴定转导后SMC行Xgal染色。方法：吸去细胞上清，5g/L Glutaradehyd固定细胞后，PBS清洗3遍后染色。Xgal染液：1g/L XGal (Gibco BRL)，2mmol/L MgCl2，5mmol/L K3Fe(CN)6和5mmol/L K4Fe(CN)6的PBS液，37过夜后倒置显微镜下计数10个随机高倍视野下(200)蓝染细胞与总细胞的比率(图2)。2.4 基因转导效率的比较分别将假型逆转录病毒MuLV/VSVG及鼠白血病病毒MuLV转导兔平滑肌细胞，发现MuLV/VSVG的转导效率明显高于MuLV。MuLV/VSVG的转导效率为(9212)%，MuLV转导效率为(245)%，二者差异比较有显著性(P<0.01)。3 讨论 平滑肌细胞是血管壁的主要细胞成分之一，血管平滑肌细胞增生是血管性疾病如动脉粥样硬化和移植血管再狭窄的重要原因。将相关基因转导到平滑肌细胞中抑制平滑肌细胞增生可以达到治疗血管性疾病的目的。 平滑肌细胞作为基因治疗的靶细胞具有很多独特的优越性如易获取和体外扩增，易受外源基因的转染并能稳定地表达外源基因，致瘤性低和相对其他细胞安全等8。 载体的选择直接决定了基因表达的有效性、表达持续时间以及转染的安全性。腺病毒载体作为一种常用的载体转染效率较高，但由于被转染的基因没有融合到染色体，基因的表达是短暂的。而MuLV衍生的逆转录病毒载体可以稳定的转染基因并长期表达。但逆转录病毒载体因转染效率较低7，需要通过筛选来杀死未被转染的细胞。为了筛选，需要在基因结构中加入抗性基因和相关的启动子。例如，新霉素类G418，来杀死未转导的细胞。只有转染了目的基因和抗性基因的细胞才能存活下来。如果载体转染基因的效率接近100%，筛选的过程就可以省略。省略筛选既可以简化基因的结构又可以减少筛选的时间和存活细胞复制的时间。提高基因转染效率是逆转录病毒载体用于基因转染的关键。VSVG/MuLV将报告基因lacZ转染到平滑肌细胞的效率达到90%，几乎所有的细胞都被转染，所以可以认为筛选已经不必要了。假型逆转录病毒载体VSVG/MuLV具有高效的基因转导功能4，有以下几种因素：VSVG包膜糖蛋白是单链肽，比MuLV更稳定，稳定的包膜有利于高滴度病毒上清液的产生，提高转导效率。可以更多地结合病毒的受体，以便VSVG/MuLV与细胞结合。 采用小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞对重组逆转录病毒液进行滴度测定，是由于NIH3T3容易在体外培养，具有较长的寿命，容易被外源基因转导，是良好的基因转移靶细胞。本研究成功的构建了假型逆转录病毒载体VSVG/MuLV，用于转染平滑肌细胞获得了较高的转导效率，说明该载体可以用于平滑肌细胞的基因转染并进一步应用于基因治疗之中。【参考文献】 1陈勇兵，陈如冲，陈力新. 型假型逆转录病毒载体的构建 J. 江苏医药杂志, 2004, 30(9):644646.2YU H, ETON D, WANG Y, et al. High efficiency in vitro gene transfer into vascular tissues using a pseudo typed retroviral vector without pseudo transduction J. Gene Ther, 1999, 6(11):18761883.3SONEOKA Y, CANNON PM, RAMSDALE EF, et al. A transient three plasmid expression system for the production of high titer retroviral vector J. Nucleic Acids Res, 1995, 23(4):628633.4SCHOLL FG, SEN L, DRINKWATER DC, et al. Effects of human tissue plasminogen gene transfer on allograft coronary atherosclerosis J. Heart Lung Transplant, 2001, 20(3):322329.5司徒镇强，吴军正. 细胞培养 M. 西安：世界图书出版西安公司， 2004:7177.6DARWIN E, THOMAS