再生障碍性贫血患者T细胞亚群检测的临床意义.doc

再生障碍性贫血患者T细胞亚群检测的临床意义 作者：张强， 李庆， 徐静玮， 张爱梅， 徐修才， 翟志敏【摘要】 本研究探讨再生障碍性贫血(AA)患者外周血T细胞亚群的变化及其与AA发病、免疫抑制治疗之间的关系；为AA患者合理选择治疗方案提供依据。以88例临床确诊为AA、并分别接受常规和常规联合免疫抑制治疗的患者为对象，采用三色免疫荧光抗体标记法和流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群及CD4+和CD8+比值，参考正常对照组水平将患者分为比值正常型、比值倒置型和比值超高型3个免疫亚型，分析和比较各亚型与病情、疗效之间的关系。结果表明： CD4+/CD8+比值正常型占39.8%、比值倒置型占44.3%、比值超高型占15.9%。免疫亚型、治疗方法与总有效率的关系为：单独常规治疗时， 3个亚型组之间疗效无明显差异；当联合免疫抑制治疗时，比值正常型患者的总有效率与常规治疗相比无显著改变，而比值倒置型及免疫异常型(比值倒置型+比值超高型)患者有效率较同组常规治疗疗效均显著提高(84.2% vs 45.5%及82.6% vs 42.8%， p值均<0.05)，也显著高于比值正常型患者(84.2%及82.6% vs 52.6%，p值均<0.05)。结论： 大多数AA患者存在严重的CD4+和CD8+比值失调，CD4+/CD8+异常既可表现为降低，也可以是异常增高，AA发病机制与免疫异常有密切相关性；T细胞亚群检测对临床了解病情和发病机制、合理选择治疗方案、提高诊断和治疗水平具有重要价值。 【关键词】 再生障碍性贫血 Clinical Significance of Detection of Tcell Subgroups in Patients with Aplastic Anemia Abstract The study was aimed to investigate the changes of Tcell subgroups in the peripheral blood (PB) of patients with aplastic anemia (AA) and the relationships between these changes and the pathogenesis of AA and the immunosuppressive therapeutic effects in AA, in order to provide a basis for selecting rational therapy of AA patients. Tcell subtype and the ratio of CD4+/CD8+ cell in the PB of 88 AA patients which had been diagnosed clearly and given conventional therapy or conventional therapy combined with immunotherapy were analyzed by tricolour fluorescence labeled monoclonal antibody and using multiparameter flow cytometry. The patients with AA were divided into normal type of ratio, inverted type of ratio, hypernormal type of ratio according to the ratio of CD4+/CD8+ cell in normal group, and then the relations of these subtype with patients conditions and therapeutic effects were investigated. The results showed that the percentage of normal type of ratio in all patients was 39.8%, the percentage of inverted type of ratio in all patients was 44.3%, The percentage of hypernormal type of ratio in all patients was 15.9%. In the conventional therapy alone, there was no significant difference on therapeutic effects among these three immunological subtypes. In combined immunotheray, total therapeutic effecacy of AA patients with inverted type of ratio and AA patients with immunologic abnormality ( inverted type +hypernormal type) was 84.2% and 82.6% respectively, which were more than that in conventional therapy (45.5% and 42.8%) (p<0.05). Total therapeutic effecacy in these patients was better than that in AA patients with normal type. It is concluded that significant abnormal ratios of CD4+/CD8+ exist in the majority of AA patients, abnormal ratios of CD4+/CD8+ both may be showed as increase or decrease, immunologic abnormality may play a role in pathogenesis of the patients with AA. The detection of PB Tcell subtype in patients with aplastic anemia contributes to evaluation of patients condition and choice of rational treatment prescription, and enhanement of diagnostic level and therapeutic efficacy significantly, which is an important indicator for therapeutic strategy also. Key words aplastic anemia; immunologic abnormality; Tcell subgroup; CD4, CD8 J Exp Hematol 2007; 15(5):1046-1049 目前临床上用来判断再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)患者细胞免疫功能状态最常用的指标为CD3+、CD3+CD4+(简称CD4+)、CD3+CD8+(简称CD8+)T淋巴细胞亚群的检测，且大多数研究结果显示AA患者总体CD4+/CD8+比值显著低于正常参考值水平，但具体分析每个AA患者CD4+/CD8+结果时，发现个体间差异非常悬殊，因此为进一步明确CD4+/CD8+检测指标在诊断AA中的意义、其与AA患者治疗方案和效果等之间的关系，我们对近3年检测的80多例AA患者的CD4+/CD8+比值和临床资料进行了回顾性分析和总结。 病例选择 2002年10月-2005年10月确诊或复发的AA患者88例，选择患者的标准是检测前1个月内未接受免疫相关治疗，检测时无发热等明显的感染症状，其中慢性再生障碍性贫血(chronic AA, CAA)65例，重型再生障碍性贫血(severe AA, SAA)23例。检测后有治疗记录并能进行完整随访及疗效评定的最终有68例，其中CAA 47例，SAA 21例。该68例AA患者根据检测后接受的治疗方式分为以下2组： 常规治疗组 以安雄或康力龙为主的雄激素刺激疗法，具体治疗方法为：安雄： 120-160 mg/d；康力龙： 4-8 mg/kgd)。 免疫治疗组，在常规治疗的基础上加用免疫抑制剂，即单加环孢素A(CsA)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)中的任何一种或两种联合使用，具体治疗方法为： CsA 3-6 mg/(kgd)，分2-3次口服，疗程3-4个月, ATG 10 mg/(kgd)或ALG 2.5 mg/(kgd)，连续5天静脉滴注，并适当添加山莨菪碱（654-2）或中成药等常规辅助治疗。部分患者因病情需要曾接受对症支持治疗，如抗生素预防或控制感染，有严重贫血及出血倾向时，输注全血或红细胞、血小板等。诊断及疗效评价标准参照张之南等编著1998年第二版血液病诊断及疗效标准1。正常对照组以2003年7月-2004年7月在我院接受常规体检且各项检验指标均在正常范围内的健康体检者60名，男32名，女28名，年龄20-55岁。性别、年龄与患者组无显著差异2。 检测方法 T细胞亚群采用结合三色荧光素的免疫单克隆抗体直接标记后，用多参数流式细胞术检测。采患者外周血2-5 ml，肝素抗凝，每份标本取2支7515 mm小试管，分别加抗凝全血100 l，再加组合的三色荧光单克隆抗体试剂CD3PC5/CD4FITC/CD8PE，均为鼠抗人抗体，亚型均为IgG1，克隆号分别为UCHT1、13B8.2、B9.11（美国Bechmancoulter公司产品)及其同型阴性对照各10 l，充分混匀后，室温下避光反应15分钟，再加溶血剂(0.83% NH4Cl，自配)1 ml，37水浴，约10分钟待完全溶血后，立刻上流式细胞仪检测(Bechman coulter公司产品，EPICSXLII型)。上机前常规采用标准荧光微球(Flow Check)对仪器进行质量监测和调试，保证各项质控数值(如各参数变异系数、不同荧光素之间的荧光补偿等)在标准范围内，然后在Acquirement程序下检测并保存数据，每次检测细胞总数10 000个以上。分析数据在Listmode软件下进行，根据前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)信号，对淋巴细胞群进行设门，然后在双参数细胞点状图上分别找出CD3+、CD4+、CD8+细胞群及其占淋巴细胞群的百分比（%）。 统计分析 用SPSS 11.0软件包，T亚群检测结果以 SD表示，并进行方差齐性F检验和t、检验，治疗有效率比较以2检验或确切概率分析。 结 果 AA患者T细胞亚群分布情况 将所有88例AA患者合为一组与正常人群比较可见，AA患者外周血CD3+、CD8+ T细胞占淋巴细胞百分比显著高于对照组，CD4+/CD8+明显低于对照组， CD4+ T细胞与正常对照相比无明显差异（表1）。进一步具体分析各项数值发现AA患者每项指标的标准差均高，提示个体之间的离散程度非常大。为了更加准确反映AA患者与T细胞亚群之间的关系，根据本室建立的T细胞亚群CD4+/CD8+正常参考值范围(1.41-1.81)及每例患者的检测结果2，进一步将AA患者分成3个免疫亚型，即比值正常型，比值倒置型和比值超高型。比值正常型为： CD4+/CD8+在正常范围；比值倒置型为： CD4+/CD8+低于正常参考值下限；比值超高型为： CD4+/CD8+高于正常参考值上限(表2)。 CD4+/CD8+与AA患者病情之间的关系 根据患者入院时的三系细胞减少程度和全国统一标准1，可将AA分为CAA和SAA两大类型，SAA中CD4+/CD8+比值倒置型百分比显著大于CAA(表2)。 CD4+/CD8+比值与AA患者免疫抑制治疗疗效之间的关系 按全国统一标准1对接受上述不同治疗方案1年以上的有完整随访及疗效评定的68例AA患者进行疗效判定，可分为基本治愈、缓解、好转和无效，将前三种治疗效果的患者全部作为有效病例分析可见：总有效率为58.8%(40/68)。但按照治疗方法不同将患者分组后再进行比较发现常规治疗组的总有效率显著低于联合免疫抑制治疗组（42.3% vs 69.0%； p<0.05）。而根据CD4+/CD8+更进一步将患者细分为三个免疫亚型组后分析和比较两种疗法的总有效率可见：比值正常型患者两者之间无显著性差异，而比值倒置型患者采用联合免疫抑制治疗时其总有效率显著高于常规治疗组（84.2% vs 45.5%， p<0.05）。另一方面，当患者采用相同治疗方案，分析和比较不同免疫亚型组之间的总有效率时可见：常规治疗时3个亚型组之间无明显差异，但联合免疫抑制治疗时，比值倒置型及免疫异常型(比值倒置型+比值超高型)均显著高于比值正常型患者(84.2%及82.6% vs 52.6%， p值均<0.05)，(表3)。根据病情分组时，SAA组联合免疫治疗有效率显著大于常规治疗，而CAA组则无显著差异。 讨 论 AA的发病机制除与造血干细胞本身缺陷、造血微环境损伤有关外，免疫异常是一个绝对不可忽视的因素。现有学者认为，大多数患者发病与自身免疫反应导致的造血干细胞受损有关，但准确鉴别3种致病机理的手段非常有限，而明确发病机制对患者选择治疗方案和预后评价有重要价值3。目前临床最常用来了解患者细胞免疫状态的实验室指标就是T细胞亚群检测。本研究显示，AA患者外周血淋巴细胞中的CD3+细胞百分比对照组明显升高(p<0.05)，提示AA发病与T细胞介导的细胞免疫有密切关系。从T细胞亚群看，与对照组比较，CD4+细胞降低(p>0.05)，而CD8+细胞却明显升高(p<0.01)，导致CD4+/CD8+比值明显倒值(p<0.01)(表1)，这与傅晋翔等4,5研究结果基本相符。这进一步提示，CD8+细胞可能参与了AA的免疫发病机制。但具体分析个体间数值时发现，AA患者T细胞亚群各项指标的均值标准差较正常对照组大，这也就是说个体之间的离散程度非常大。为了更加准确反映AA患者与T细胞亚群之间的关系，根据本室建立的T细胞亚群CD4+/CD8+正常参考值范围(1.41-1.81)及每例患者的检测结果2，又将AA患者分成了3个亚型：比值正常型，比值倒置型和比值超高型(表2)，其具体的分布为比值正常型占39.8%、比值倒置型占44.3%、比值超高型占15.9%。由此可见，AA患者细胞免疫状况比较复杂，可能存在着多种调控路径引起的免疫紊乱，如果将CD4+/CD8+作为判断患者免疫异常的指标，比值倒置型和比值超高型共占AA患者的比例为60.2%，该数值与相关报道免疫机制异常占AA发病机制40%-70%比较符合 6,7。值得注意的是SAA中CD4+/CD8+倒置型占65.2%(15/23)，显著高于CAA患者中CD4+/CD8+倒置型的36.9%(p<0.05)，这提示SAA的发病可能与免疫异常的关系更为密切。 通过对68例有完整治疗记录及疗效评定的AA患者治疗情况回顾性分析发现，常规治疗的总有效率显著低于联合免疫抑制治疗组（42.3% vs 69.0%, p<0.05），提示总体上联合免疫抑制治疗方案优于常规治疗。然而，进一步分析3个免疫亚型组采用不同治疗方法的总有效率后发现：比值正常型患者2种治疗方案之间无显著性差异，而比值倒置型及免疫异常型患者采用联合免疫抑制治疗时其总有效率均显著高于常规治疗组。这一结果提示，只有对免疫检测有异常特别是CD4+/CD8+倒置型的AA患者采用联合免疫抑制治疗才会取得明显疗效。另一方面，分析和比较患者分别采用不同治疗方案时各免疫亚型组之间的疗效发现：常规治疗时3个亚型组之间无明显差异，但联合免疫抑制治疗时，比值倒置型及免疫异常型患者均显著高于比值正常型患者(表3)。尤其是在21例SAA中，8例应用常规治疗有效率为37.5%(3/8)，而13例联合免疫抑制治疗的患者有效率高达84.6%(11/13)，两者有显著统计学意义（p=0.041）。这些结果均与国内外相关报道基本一致8,9，进一步证明了AA患者发病机制、病情及治疗三者之间的密切关系。综合以上情况也可以从免疫异常机制来解释为什么临床上公认SAA用免疫抑制剂治疗效果较CAA显著，因为SAA中免疫异常机制可能在其发病机制中占主导地位10。 从上述分析可见，患者体内是否存在免疫异常对AA患者的病情及联合免疫治疗的效果有显著影响，SAA患者中CD4+/CD8+异常检出率明显高于CAA患者。CD4+/CD8+比值倒置型或比值超高型AA患者联合免疫抑制治疗的有效率显著高于比值正常型，而比值正常型患者选用免疫抑制治疗时效果并没有显著提高，因此临床选药时应慎重考虑或进一步验证。由于免疫抑制疗法目前已成为临床最常用治疗方法之一,而免疫抑制剂价格都比较昂贵、且有一定的副作用，因此选择方案时应该严格把握适应症。本研究充分说明检测AA患者T细胞亚群对了解患者免疫状况、合理选择治疗方案、提高诊疗水平乃至减轻患者经济负担有重要价值。本研究对比值超高型观察例数较少，有待于以后积累资料，以得出更准确的临床结论。【参考文献】 1张之南.血液病诊断及疗效标准.第二版.北京:科学出版社. 1998： 43-482徐修才,翟志敏,李庆等.五种疾病患者细胞免疫功能分析及其临床意义.中华检验医学杂志,2005； 28:9423Brodsky RA, Jones RJ. Aplastic anaemia. Lancet, 2005； 365(9471):1647-16564傅晋翔,黄海雯,施小凤等. 免疫功能异常在再生障碍性贫血发病中的作用及临床意义. 江苏医药,2004