口蹄疫病毒VP1基因重组腺病毒的构建与鉴定.doc

口蹄疫病毒VP1基因重组腺病毒的构建与鉴定 作者：苏春霞， 段相国， 张艳丽， 摆茹， 陈溥言【摘要】 目的 构建表达O型口蹄疫病毒( Foot-and-Mouth disease Virus，FMDV)VP1基因的重组腺病毒并对其进行鉴定。方法 将FMDV VP1基因克隆到腺病毒的穿梭载体pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP中。得到的阳性穿梭质粒经Pme酶线性化后，利用电转化技术将线性化的阳性质粒与腺病毒骨架载体pAdeno VatorE1/E3共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在大肠杆菌中进行同源重组。将筛选到的重组病毒质粒经Pac酶线性化后暴露出包装信号，通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK-293A细胞后得到重组病毒。利用报告基因GFP和细胞病变检测重组病毒滴度和感染效率，通过PCR和western-blot检测FMDV VP1基因在重组腺病毒中的表达。结果 成功构建了表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5-VP1，其滴度为1011.87个TCID50/mL。western-blot检测重组腺病毒rAd5-VP1能与FMDV阳性血清发生反应。结论 重组腺病毒rAd5-VP1能与FMDV阳性血清发生反应，PCR和western-blot检测FMDV VP1基因在重组腺病毒中稳定表达。 【关键词】 口蹄疫病毒;重组腺病毒;VP1基因 口蹄疫(Foot-and-Mouth disease，FMD) 是由O型口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病，属于人畜共患传染病。该病的流行不仅造成巨大的经济损失，而且直接影响到国家贸易、人类生活和健康，关系到社会安定和国际声誉1。灭活疫苗的免疫接种是控制该病的主要方法，但只能提供短期保护，而且存在病毒灭活不完全和病毒逃逸的潜在危险，因而基因工程疫苗的研究成为FMD 研究的热点之一。随着分子生物学技术的飞速发展，FMD基因工程疫苗等多种新型的疫苗都在不断的研究开发中，但在动物保护性实验中的结果并不理想2-3。对O型FMDV抗原位点的研究表明，结构蛋白VP1-VP4均参与抗原位点的形成，但发挥主要作用的是VP1。VP1能诱导感染动物产生中和性抗体，它暴露于病毒颗粒的表面，易发生变异，在FMD基因工程疫苗研究中倍受关注4-5。本研究通过把O型FMDVVP1基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP中，然后与骨架载体pAdeno VatorE1/E3在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，构建重组腺病毒并对其进行鉴定，为研究FMDV的重组腺病毒活载体疫苗奠定基础。1 材料和方法1.1 主要试剂 腺病毒载体系统包括：穿梭载体pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP和骨架质粒载体pAdeno VatorE1/E3、宿主菌DH5和BJ5183均由南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室惠赠。含有O型FMDV VP1基因的质粒pMD18-VP1由本人构建6。限制性内切酶Pme、Pac购自Gene公司，其他限制性核酸内切酶、连接酶、聚合酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)，核酸分子量标准，DNA小量凝胶回收试剂盒均购自大连TaKaRa公司。LipofectamineTM2000购自上海Invitrogen公司，Western印迹试剂盒、HRP-SPA为武汉博士德生物工程有限公司产品;其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。FMDV 的标准阳性血清为中国农业科学院兰州兽医研究所产品。1.2 方法1.2.1 转移载体pA5-VP1的构建 以pMD18-VP1为模板，重新设计扩增VP1基因的1对引物(上海Invitrogen公司合成)。P1:5-CGTAGATCTATGACCACCTCA-3 (Bgl)P2:5-GCAGATCTCTCGAGTCAAAAAGCTGTTT-3 (Bgl，Xho)PCR产物和穿梭载体pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP分别经Bgl酶切，并于4 过夜连接，氯化钙法转化大肠杆菌DH5。提质粒用Xho进行酶切鉴定其正反向。将获得的阳性重组质粒命名为pA5-VP1，送上海Invitrogen公司测序。1.2.2 pA5-VP1在大肠杆菌BJ5183中与pAdeno VatorE1/E3的同源重组 取1 L(约100 ng)纯化的骨架载体pAdenoVatorE1/E3和5 L(约1 g)经Pme线性化的转移质粒pA5-VP1在1个灭菌的离心管中混合;电转化入感受态大肠杆菌BJ5183中(电转化仪的参数设置为：2.5 kV，25 F，200 )，使其在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。获得疑似重组腺病毒质粒用Pac进行酶切鉴定，将阳性重组腺病毒质粒分别命名为pAd5-VP1。1.2.3 重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞 按碱裂解法大量提取质粒pAd5-VP1并经PEG沉淀法纯化质粒DNA，经Pac线性化，切除部分质粒构件，暴露出末端反转重复序列。按照LipofectamineTM2000说明书转染HEK-293A细胞，同时转染pAdeno VatorE1/E3载体对照。由于pA5-CMV5-IRES-GFP系统在细胞内可以表达绿色荧光蛋白(GFP)，转染后的1224 h在荧光倒置显微镜下观察荧光来判断目的基因是否表达，如果观察到荧光，继续培养710d，每天观察荧光和细胞病变(CPE)。当出现明显的细胞病变效应时，将细胞回收，-80冻存。1.2.4 重组病毒的纯化、鉴定及TCID50的测定 利用无限稀释法进行纯化。具体方法：在96孔细胞培养板上，每孔接种5104个HEK-293A细胞，至80%密度时，在无血清培养液中感染病毒。重组病毒按连续10倍梯度稀至10-10，每个稀释度接种8个孔，并设立空白对照。感染12h换成细胞培养维持液。通过观察噬斑的形成过程，选取单噬斑孔细胞进行扩大培养。阳性重组腺病毒经PCR和Western-blot 鉴定。并测定重组病毒的TCID50。纯化后的重组腺病毒在HEK-293A细胞上连续传代10代，然后测TCID50，检测重组病毒是否稳定。2 结果2.1 转移载体pA5-VP1的构建2.1.1 目的基因的扩增 以pMD18-VP1为模板，用引物P1、P2扩增出大小约639 bp的条带，结果如图1。1-3.VP1的PCR扩增结果;M.DL2000图1 VP1基因的PCR扩增2.1.2 转移载体的构建 在pA5-CMV5-IRES-GFP载体Bgl酶切位点的上游350 bp处有一个Xho位点，此位点也是载体上单一的酶切位点。在扩增目的基因的下游引物上设计一个Xho位点，将构建的转移载体用Xho单酶切来鉴定目的基因是否插入载体中，并鉴定插入方向是否正确，如果目的基因正向插入载体中，酶切后可出现1kd左右的酶切片段，结果如图2。2.2 同源重组腺病毒质粒pAd5-VP1的线性化鉴定 在大肠杆菌BJ5183中筛选的重组病毒质粒，用Pac单酶切，在0.7%的琼脂糖凝胶电泳中出现两条带：分别为35 kb和4.5 kb，如图3。将阳性重组病毒质粒分别命名为pAd5-VP1。2.3 重组病毒的产生2.3.1 重组病毒的荧光观察 线性化重组病毒质粒pAd5-VP1转染HEK-293A细胞，置37 ，5% CO2培养箱培养12h后观察到荧光，说明质粒已在细胞中表达。继续培养，7d后细胞逐渐开始变圆、脱落，10d以后出现较为明显的细胞病变，见图4(见封4)。反复冻融3次后，-20保存。2.3.2 重组病毒的PCR检测 提取重组病毒的基因组作为模板，同时以pAdenoVatorE1/E3作阴性对照;分别用引物P1、P2进行PCR扩增，重组病毒的基因组作为模板，PCR产物出现预期的条带，而阴性对照没出现条带。结果如图5。2.3.3 重组病毒的Western-blot鉴定 Western-blot所用一抗为FMDV 的标准阳性血清，二抗为HRP-SPA，重组病毒能与FMDV 的标准阳性血清发生特异性反应，DAB显色后出现特异性的条带，而阴性对照没有出现任何条带。如图6(见封4)。2.3.4 重组病毒的纯化及滴度测定 采用无限稀释法对重组病毒进行纯化，随后测定纯化病毒的TCID50，测得rAd5-VP1的滴度为1011.87TCID50/mL。2.3.5 重组病毒的稳定性试验 重组病毒在HEK-293A细胞上连续传代10代后再测定TCID50，重组腺病毒效价稳定。3 讨论目前制备重组腺病毒常用方法是细胞内质粒DNA同源重组法与细菌内同源重组法。细胞内同源重组涉及的步骤及环节较多、成功率较低、工作量大、实验周期长。为了缩短实验周期，提高效率，许多学者成功地采用特定的大肠杆菌来完成同源重组、重组病毒核酸的筛选和扩增过程，其中pAdEasy系统最具有代表性7-8。在此系统中，利用分子生物学技术构建2种特殊质粒：骨架质粒和穿梭质粒。骨架质粒带有细菌ori和氨苄青霉素抗性编码基因，含有腺病毒大部分基因组;穿梭质粒具有ori，卡那霉素抗性编码基因，腺病毒的左臂和右臂同源区以介导在大肠杆菌内与骨架质粒上腺病毒基因组的同源重组。将目的基因克隆至穿梭质粒，然后将线性化的穿梭质粒和超螺旋的骨架质粒用电穿孔转化具有修饰作用的特定的大肠杆菌BJ5183进行同源重组，所得重组腺病毒质粒可以通过卡那霉素抗性方便筛出，由于细菌内高效度的重组机制，可以在很短的时间内得到所需要的重组腺病毒，再用人工创建的Pac位点酶切，即可用于转染真核细胞。我们选用的pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP质粒中带有GFP报告基因，可用于直接观察转染和感染效率及监测重组病毒的滴度，用鉴定正确的重组体腺病毒质粒转染HEK-293A细胞，包装产生的腺病毒可省却细胞内同源重组法对包装病毒必须进行的多轮费时、费力的筛选和鉴定。本研究中构建的表达FMDV 主要保护性抗原VP1重组腺病毒具有与口蹄疫阳性血清反应的能力，连续传10代效价稳定且可稳定表达VP1基因，为后期的动物试验奠定基础。【参考文献】 1 Grubman MJ, Baxt B. Foot and mouth disease J. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(2):465-493.2 Wang GH , Du JZ, Cong GZ, et al. Establishment of indirect ELISA diagnose based on the VP1 structural protein of foot and mouth disease virus FMDV in pigsJ. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao ,2007 ,23(5):961-966.3 Zhuang J, You YJ, Chen B, et al. The immune responses of the fusion protein consisted of two copies of T-cell and B-cell epitopes of food and mouth disease virus VP1 type O and LTB and STI enterotoxins of J. Yi Chuan, Escherichia coli, 2006, 28(5):557-562.4 Fan H, Tong T,Chen H ,et al. Immunization of DNA vaccine encoding C3d-VP1 fusion enhanced protective immune response against foot2and2mouth disease virus J. Virus Genes, 2007, 35(2):347-357.5 Ping Qian, Xiang-Min Li, Mei-Lin Jin, et al. An approach to a FMD vaccine based on genetic engineered attenuated pseudorabies virus: one experiment using VP1 gene alone generates an antibody responds on FMD and pseudorabies in swineJ. Vaccine, 2004 ,22: 2129-2136.6 苏春霞，段相国，王秀青，等. FMDV VP1基因与HSP7