液质联用技术及其应用.ppt

by Li Ping,1,安捷伦-液质联用技术(LC/MS)及其应用,by Li Ping,2,液质(LC/MS)联用技术基础,by Li Ping,3,质谱分析仪(MS) 需要高真空条件 质量分析系统 最好使用挥发性缓冲液,液相(HPLC) 高效分离混合物 流动相挥发后产生大量气体 出口压力为大气压 无质量限制 可以使用缓冲盐溶液,液相(HPLC) 到 质谱(MS)的接口,by Li Ping,4,LC-MS的接口的发展和种类,传送带(moving belt)式的LC-MS: 目前已经停用 热喷雾(TSP) LC-MS接口: 已经很少使用 粒子束(PBI) 大气压电离源(API):目前最常用的方法 电喷雾(ESI) 大气压化学电离源(APcI),by Li Ping,5,LC/MS联用技术的相对适用范围,by Li Ping,6,大气压电喷雾质谱应用范围,大气压电喷雾源,大气压化学源,分子量,化合物极性,1000,100,000,10,000,非极性,极性化合物,气相色谱/质谱,by Li Ping,7,库仑爆炸 （Coulomb Explosions）,Rayleigh Limit Reached,+,带电液滴,分析物离子,溶剂离子束,分析物离子 溶剂离子束 盐/离子对 中性化和物,电喷雾(ESI)的电离过程,by Li Ping,8,Neutral Molecules Analyte Ions Clusters Salts,毛细管,液相的入口,雾化器,加热 N2,雾化气入口,碎片碰撞电压 (CID),锥孔,八极杆,四极杆,高能打拿极/电子倍增器,+,+,+,+,+,透镜,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,液质联用的电喷雾(ESI)接口,by Li Ping,9,ES电离原理,by Li Ping,10,蒸汽,通过电晕针放电形成带电荷的反应剂离子,溶剂在蒸发器中蒸发,+,含有气溶胶的分析物,分析物离子,电荷转移至 分析物分子,+,+,+,+,流动相,分析物,溶剂-溶剂+H+ 溶剂+H+M-溶剂+M+,大气压化学电离源(APCI)的电离过程,by Li Ping,11,碎片碰撞电压（CID）,锥孔,透镜,四极杆,+,+,+,+,热氮气,液质联用的大气压化学电离源(APCI)接口,高能打拿极/电子倍增器,by Li Ping,12,APCI电离原理,by Li Ping,13,大气压源子化技术,电喷雾(ESI) 化合物无需具有挥发性 是分析热不稳定化和物的首选方法 离子在溶液中以已生成 除了生成单电荷离子之外还可以生成多电荷离子,大气压化学电离源(APCI) 化和物需具有一定的挥发性 化和物必需是热稳定的 离子在气态条件中生成 只生成单电荷离子,by Li Ping,14,电喷雾(ESI)和大气压化学离子化(APCI),农药及残留化合物 多肽及蛋白的分子量测定 确定氨基酸序列 多肽及蛋白的纯度分析 单糖和多糖的结构分析 中极性到高极性,包括离子化合物的分析,如表面活性剂分析,农药及残留化合物 抗生素 碱性药物 小分子量样品 类固醇, 雌激素 单磺酸偶氮染料,ESI,APCI,by Li Ping,15,什麽是诱导解离碰撞? (Collision Induced Dissociation)?,在特定的区域, 通过与氮气分子碰撞导致分子解离, 从而产生特征碎片离子 可以得到结构信息用于化和物的定性分析 可以提供用于定量分析目地的确任碎片离子 只要改变单一参数“fragmentor”来控制CID.,by Li Ping,16,碰撞电压值对质谱图的影响,by Li Ping,17,Excellence through Evolution,安捷伦液-质联用仪介绍,by Li Ping,18,液质(LC/MS)联用系统的示意图,离子源,离子束 聚焦,M/Z 分析器,检测器,数据 处理,HPLC,LC 接口,质谱图,by Li Ping,19,安捷伦LC/MS 产品家族,液相/离子井质谱 (VL和SL),液相/单四极杆质谱 LC/MSD VL,液相/单四极杆质谱 LC/MSD SL,by Li Ping,20,四极杆质谱,+,+,+,+,+,+,Main RF,Low Amplitude Dipole Field (1/3 Frequency of the Main RF),Conversion Dynode,Electron Multiplier,Shutter,Optimized Asymptote Angle,Octapole,Ring,多极离子阱质谱,by Li Ping,21,安捷伦的专利技术 直角喷雾接口,提高灵敏度 减少污染 降低毛细管被堵塞 对非挥发性缓冲液的忍耐能力强,by Li Ping,22,独一无二的交叉喷雾器,交叉喷雾器不需 X,Y, Z 位置调整, 而且避免了离子光学透镜的污染,倾斜排水口可以快速去除冷凝液,by Li Ping,23,完成整个分析后, 毛细管的入口处还是干静的!,在非常复杂的基质的条件下 - 汉克盐溶液(Hanks),Component g/L Sodium chloride 8 Calcium chloride 0.1 Potassium chloride 0.4 Potassium phosphate monobasic 0.06 Magnesium Sulfate 0.1 Sodium bicarbonate 0.35 Sodium phosphate dibasic 0.048 Glucose 1 Phenol red 0.011,by Li Ping,24,清洁喷雾室,在APCI的条件下,流动相为HBSS,连续进样635次以后,完成整个分析后, 毛细管的入口处还是干静的!,by Li Ping,25,内置式较正溶液 用于全自动调谐和质量较正,全自动调谐和质量较正,by Li Ping,26,安捷伦1100 系列 LC/MSD: 易懂,易用的图型化的液相和质谱控制及分析软件,by Li Ping,27,哪一种离子化模式最好?,不知道要分析的化合物的性质是酸性或碱性 要分析的化合物中同时包含酸性和碱性化合物 酸性和碱性化合物的浓度不同,by Li Ping,28,可同时采集多种质谱信号: 正离子和负离子模式,采集50组，30个离子/组离子,同时采集正负离子,by Li Ping,29,我经常筛选未知物. 最好是同时获得分子量和一些碎片信息,我正在筛选未知物,但我不知道最优的碰撞电压 我希望一次能获得在不同碰撞电压条件下的谱图,可同时采集多种质谱信号: 高和低CID能量,by Li Ping,30,低CID能量,高CID能量,可同时采集多种质谱信号: 高和低CID能量,by Li Ping,31,High fragmentor: 130 V,Low fragmentor: 65 V,可同时采集多种质谱信号: 高和低CID能量,磺胺药物演示混合样,by Li Ping,32,可同时采集多种质谱信号: SIM/Scan,SIM 来定量所选的目标化合物离子,对未知的化合物SCAN,by Li Ping,33,Scan,SIM,磺胺药物演示混合样,可同时采集多种质谱信号: SIM/Scan,by Li Ping,34,可同时采集多种质谱信号: 时间编程信号,1) 开始五分钟不采集信号 5分钟开始采集信号 信号关闭采集,Improve data quality and manage data file size:,by Li Ping,35,从每一项分析中获得最大的信息,一针注射样品可获得任意以下分析模式最多达四种 1. 高/低 CID能量可获得分子量及碎片信息用于确认化 合物的结构 2. 正/负 离子化模式 3. SIM/Full Scan 模式,by Li Ping,36,如何建立自己的 HPLC/ESI和HPLC/APCI谱库,by Li Ping,37,质谱库检索特点,检索用户自建谱库 使用 NIST 程序和检索规则 没有应用独特的筛选,如PBM 谱库可以包含结构式 交互式或自动检索 DAD/MSD 组合检索报告,by Li Ping,38,自动生成谱库检索报告,Library search mode: Automatic library search Library file No. : 1 Library file name : S:SPYDERMSLIBR1DOUGLIB.UVL Match threshold : 950 Purity threshold: Calculated Time window left % : None Case sensitive : No Time window right % : None Whole word : No Wavelength shift : 0.0 Compare spectrum : Yes Absorbance threshold : 0.0 Search logic : OR Search range : All Signal 1: DAD1 A, Sig=254,8 Ref=450,80 Signal 2: MSD1 TIC, MS File NIST MS library search mode: Automatic library search NIST MS library file No. : 1 NIST MS library file name : douglib RetTime Sig MW Library Match Formula Name min # Id -|-|-|-|-|-|-|- 2.746 2 270 1 4 720 C9H10N4O2S2 Sulfamethizole 2.987 2 278 1 5 748 C12H14N4O2S Sulfamethazine 3.571 2 284 1 6 583 C10H9ClN4O2S Sulfachloropyridazine 6.143 2 310 1 25 868 C12H14N4O4S Sulfadimethoxine,by Li Ping,39,SIM 灵敏度 API-electrospray at 400 l/min or APCI at 1000 l/min Selected ion monitoring of m/z 609.3 Positive ionization VL 10 pg reserpine 50:1 RMS (10:1 peak-to-peak) SL 1.0 pg reserpine 50:1 RMS (10:1 peak-to-peak),Unsurpassed performance!,卓越的操作性能指标,by Li Ping,40,LC/MSD SL: 利血平(电喷雾, SIM 模式),Chromatographic Conditions Column: 30 x 2.1mm Zorbax Rapid Resolution SB-C8, 3.5 m (p/n 873700-902) Mobile phase: 5 mM each ammonium formate in 75% methanol in water Flow rate: 0.4 ml/min Injection amount: 1 or 2 pg on column ESI MS Conditions Source: ESI Ion mode: positive SIM ions: 609 Fragmentor: 200 V,2 pg reserpine,1 pg reserpine,by Li Ping,41,LC/MSD SL:利血平(大气压化学离子化, SIM 模式),Chromatographic Conditions Column: 30 x 2.1mm Zorbax Rapid Resolution SB-C8, 3.5 m (p/n 873700-902) Mobile phase: 5 mM each ammonium formate in 75% methanol in water Flow rate: 1 ml/min Injection amount: 1 or 2 pg on column APCI MS Conditions Source: APCI Ion mode: positive SIM ions: 609 Fragmentor: 200 V Vaporizer: 450C Drying gas: 350C, 5 l/min Nebulizer: 50 psig,1 pg reserpine,by Li Ping,42,安捷伦-液质联用技术,1.具有多年的台式质谱研究经验； 2. 直角接口的设计，保证仪器耐缓冲盐，提高灵敏 度及易于清洗离子源和接口多重目的； 3.同一厂家的产品，工作站的一体化控制，同时 采集色谱和质谱信号； 4.具有自动调谐和手动调协两种方式； 5.APCI和API-ES源转换方便，5min即可完成； 6.在实验室条件下，0.4-1.5ml/min流速下达到最高的 灵敏度； 7.同时采集正负离子模式；,by Li Ping,43,Agilent 1100 Series LC/MSD: 应用分析举例,在农药合成及农药残留分析中的应用 在高分子添加剂分析中应用 在染料(如偶氮染料)分析中的应用 在双酚A,壬基酚及表面活性剂分析中的应用 在激素及兴奋剂分析中的应用 在蛋白质及多肽分析中的应用 在糖类化合物分析中的应用 在天然产物分析中的应用,by Li Ping,44,氨基甲酸盐类化合物(Carbamates) 磺酰脲类(Sulfonyl Ureas) 苯脲类(Phenyl Ureas) 其它农药及其残留化合物,LC/MSD在农药及农药残留分析中的应用,by Li Ping,45,Tomato extract spiked with 11 carbamates 200 pg/l; 50 l injected; Scan mode,APCI-LC/MS氨基甲酸盐类化合物的分析,by Li Ping,46,APCI-LC/MS氨基甲酸盐类化合物的分析,对于1ppb氨基甲酸盐类化合HPLC的分析: 柱后衍生,然后用萤光检测器分析 LC/MS: 进样量: 50ul X 200pg/ul 柱子: 100X4mm I.d, 3um Hypersil ODS 溶剂 A: Water 溶剂B: Methanol 梯度: 25 to 75% B in 20min UV Detector=214nm Flow rate: 0.8ml/min MS: Mass Scan range: 100 to 510 amu APCI Vap=400C Drying gas temp=350C,by Li Ping,47,氨基甲酸盐化合物的总离子图及提取离子谱图,草氨酰,涕灭威,涕灭威砜,涕灭威亚砜,西维因,猛杀威,by Li Ping,48,41.5 pg/component,Increased Sensitivity for Carbamates Using SIM,MS TIC,m/z 132,m/z 226,m/z 202,m/z 222,aldicarb sulfoxide,carbofuran,carbaryl,promecarb,by Li Ping,49,* Final sample concentration for carbamates equals 2 g/ml * 3 ul inj on a 2.0 mm x 150 mm Phenomenex C-18 * 10 ul inj on a 4.6 mm x 250 mm Pickering C-18,检测的比较,florida CDFA Methodology,克百威,敌灭威亚碸,草氨酰,甲氨叉威,3-羟基克百威,敌灭威,西维因,灭虫威,by Li Ping,50,50 l of 1 ppb injected, SIM,除草剂的APCI-LC/MS 分析谱图的提取离子图,氰草津,西玛津,莠草津,环嗪酮,by Li Ping,51,* 50 l of 1 ppb injected (50 pg on column), 2-OH-atrazine may shift, and is very dependant on column equilibration and pH,利用APCI-LC/MS 正离子/选择离子模式分析除草剂的结果,by Li Ping,52,Scan mode, 20 ppm/component,APCI-LC/MS用于苯脲除草剂的分析,立谷隆,敌草隆,绿谷隆,甲谷隆,绿麦隆,by Li Ping,53,分析苯脲类除草剂的LC/MS 条件,LC conditions: Column 200 X 2.1 mm C18 Mobile phase A: Water B: Methanol Gradient: 50-80% within 3 min Flow Rate: 0.4ml/min UV Detector=254 nm MS: Mass Scan: 100-400amu, Positive in APCI Corona needle=6uA, Vaporize Temp=400C Drying gas Temp=325C, 4.0 L/min Nebulizer Gas Presure: 30psi,by Li Ping,54,Electrospray positive ion mode, SIM,Sulfonylureas,min,by Li Ping,55,液质联用(LC/MS)技术在 聚合物添加剂分析中的应用,by Li Ping,56,聚合物润滑添加剂:,作用: 减少摩擦系数,Behenamide(山俞酸酰胺),CH3(CH2)18CONH2, MW 311.3 和 CH3(CH2)20CONH2, MW 339.3,Erucamide(芥酸酰胺),CH3(CH2)7CH=CH (CH2)11CONH2 MW 337.3,by Li Ping,57,聚合物润滑添加剂: APCI 正离子模式-分析山俞酸酰胺(Behenamide) 样品,Time (min.),Ion Abundance,CH3(CH2)16CONH2,m/z,CH3(CH2)18CONH2,CH3(CH2)20CONH2,by Li Ping,58,Time (min.),Ion Abundance,0,2,4,6,8,10,12,14,m/z,250,300,350,400,450,0,20000,40000,60000,80000,100000,120000,338.3,339.3,250,300,350,400,450,0,2000,4000,6000,8000,10000,12000,338.3,436.4,339.2,437.5,411.2,312.1,356.3,284.3,Ion Abundance,Ion Abundance,聚合物润滑添加剂: APCI 正离子模式-分析芥酸酰胺(Erucamide)样品,by Li Ping,59,抗氧添加剂,作用: 防止聚合物在挤出时,由于氧化而受到破坏,Irgafos 168 MW 646.6,Irganox 1076 MW 530.4,by Li Ping,60,抗氧添加剂, Irgafos 168 by Positive Ion APCI,Irgafos 168 MW 646.6,0,50000,100000,150000,200000,250000,300000,663.5,664.5,665.5,607.4,0,200000,400000,600000,800000,1E6,647.5,648.5,649.5,M +16,m/z,0,2,4,6,8,10,12,14,16,0,500000,1000000,1500000,2000000,2500000,3000000,Time (min.),Ion Abundance,Ion Abundance,Ion Abundance,by Li Ping,61,Irganox 1076 by Negative Ion APCI,0,2,4,6,8,10,12,14,-5,-2.5,0,2.5,5,7.5,10,0,2,4,6,8,10,12,14,UV Signal 280 nm,Total Ion Chromatogram Negative Ion APCI,Time (min.),mAU,Ion Abundance,Irganox 1076 MW 530.4,m/z,Ion Abundance,by Li Ping,62,抗氧添加剂,Irganox 1010 MW 1176.7,Irganox B225 50% Irganox 1010 50% Irgafos 168,by Li Ping,63,LC/MS Analysis of Irganox B225 by APCI,0,20000,40000,60000,80000,100000,120000,140000,160000,600,800,0,20000,40000,60000,80000,731.5,675.3,619.3,785.3,600,800,0,100000,200000,300000,400000,500000,647.5,679.5,m/z,Ion Abundance,Pea