测定巨细胞病毒特异性抗体亲和指数的诊断价值.doc

测定巨细胞病毒特异性抗体亲和指数的诊断价值 作者：牛向兰 林浦 李欣 谷学英 马旭【摘要】 目的 以快速、简便的人巨细胞病毒特异性抗体亲和指数(CMV-IgG AI)检测方法作为有效的诊断工具，用于区分孕妇CMV原发感染与非原发感染。方法以标准的间接ELISA方法，8.0 mol/L尿素作为温和蛋白变性剂，用标准曲线方法定量测定标本中的CMV-IgG含量。 结果共检测218例标本，其中187例为CMV既往感染标本，31例为继发或再感染、可疑原发感染和原发感染标本。以抗体亲和指数<35.0 %作为阳性判断标准，此时方法的灵敏度为75.0 %，特异度为91.4 %，可用度为67.2 %。既往感染、继发或再感染、可疑原发感染、原发感染4组的平均AI值分别是(61.4225.69) %,(70.3821.88) %, (66.7323.62) %,(29.7825.93) %,原发感染组与其它3组非原发感染比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结论以8.0 mol/L尿素作为温和蛋白变性剂，用标准曲线方法定量测定标本中CMV-IgG含量适用于检测巨细胞病毒IgG抗体亲和指数(CMV-IgG AI)，认为CMV-IgM联合CMV-IgG AI检测是区分原发与非原发感染的血清学方法之一。 【关键词】 巨细胞病毒;亲和指数;IgG抗体;原发感染;酶联免疫吸附试验【Abstract】 Objective To establish a rapid, easy and simple method for determination of CMV-IgG AI to serve as effective diagnostic tool to distinguish primary CMV infection from non-primary infection in pregnant women. Methods The measurement of CMV-IgG AI is accomplished by standard indirect ELISA method using 8 mol/L urea as a mild protein denaturing agent and the amount of CMV-IgG in the specimen was measured quantitatively using a standard curve method. Results Of the 218 samples, 187 were from women with past CMV infection and 31 from those with secondary infection or re-infection, suspicious primary infection and primary infection. When the CMV-IgG AI less than 35.0 % was defined as positive, the sensitivity was 75.0 %, the specificity was 91.4 %, and availability was 67.2 %. The mean AI in the samples from women with past infection , secondary infection or re-infection, suspicious primary infection and primary infection was( 61.4225.69)%, (70.3821.88)%, ( 66.7323.62)%, (29.7825.93)%, respectively. There is a statistical difference between the primary and non-primary CMV infection (P<0.01). Conclusion The amount of CMV-IgG in the specimen quantitatively measured by a standard curve with 8 m urea solution as a mild protein denaturing agent, was found to be suitable for determination CMV-IgG AI. At present the combination of CMV-IgG AI and CMV-IgM assay seem to be one of the best serological tests for differentiating primary CMV infection from non-primary CMV infection.【Key words】 Cytomegalovirus; Avidity index; IgG antibody, primary infection; Enzyme-linked immunosorbent assay( ELISA)人巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)是可以引发宫内感染最常见的病毒之一，对胎儿危害极大，可引发胎儿多种病变或畸形1，在活产儿中感染率为0.2 %2.0 %左右，是风疹的2倍2。先天性CMV感染也是引起先天智力低下的主要原因之一，仅次于唐氏综合征3，在先天性耳聋中也有近1/2是由先天性CMV感染引起的4。尽管已知继发、再感染和原发感染均可造成对胎儿的危害，但是无论从其危害的程度，还是发生危害的频率来看，原发感染都是最主要的。因此正确、及时的区分孕妇CMV感染类型，在预防和减少具有严重出生缺陷的先天性CMV感染儿方面具有重要意义。CMV-IgM阳性为活动性感染的标志，单一CMV-IgM阳性并不能区分继发感染、再感染或原发感染5，而且CMV-IgM目前尚无统一的国际标准，一般是根据各自实验室的标准进行判断。在孕早期检测CMV-IgG抗体亲和指数(avidity index，AI)是区分CMV原发感染与继发感染的新方法69。本文对31例检测为CMV-IgM阳性的标本进行CMV-IgG AI检测，并以187例CMV-IgG阳性，同时CMV-IgM阴性的CMV既往感染标本作为对照进行了尝试性研究，结果报道如下。对象与方法一、对象1.标本来源：深圳市宝安区计生专科医院和妇幼保健院2005年3月至2007年3月收集的187例1835岁育龄妇女有CMV既往感染史标本， CMV-IgG阳性同时CMV-IgM阴性。40例近期原发、继发或再感染标本分别收集于北京市中日友好医院、北京市第一传染病医院、北京大学第三医院和北京市友谊医院检验科，初筛CMV-IgM为阳性，收集后统一再用Sorin公司CMV-IgG和IgM检测试剂盒检测，结果有31例CMV-IgM和CMV-IgG均为阳性，此31例血清作为近期原发、继发或再感染的标本。二、方法1.CMV-IgG AI的测定方法：用已标定的不同含量的CMV-IgG标准血清作为标准品，加入已被纯化的CMV抗原的聚苯乙烯板孔内作标准曲线。血清标本均作1101稀释，每例标本作平行2孔，37 孵育60 mins后甩去标本液，1孔用PBST洗5次，另1孔用PBST洗1次后，再用8.0 mol/L尿素洗3次，每次间隔3 min，最后再用PBST洗1次，然后于所有孔内加入16 000的辣根过氧化物酶标记的兔抗人-IgG结合物(丹麦 DAKO生产)，每孔100 (l，37 孵育60 min，甩去孔内液体再次用PBST洗5次扣干，于每孔内加入底物显色，室温静置30 min后用2.0 mol/L H2SO4终止反应，于酶标仪上用450 nm测定各孔吸光度(optical density,OD)值，通过标准曲线计算出每孔标本之CMV-IgG含量。2.材料和仪器：CMV-IgG和IgM检测试剂盒(意大利Sorin公司生产)检测，CMV-IgG AI检测试剂盒由“出生缺陷干预研究”课题组研制;尿素sigma公司生产，购自北京欣经科生物技术公司;美国Bio-Rad 550型酶联免疫分析仪。3.AI值的计算：AI=尿素洗涤孔内标本之CMV-IgG含量(IU/ml)/PBST洗涤孔内标本之CMV-IgG含量(IU/ml)100 %4.CMV-IgM诊断标准：CMV-IgM OD值与临界值(Cut-off)的比值<1.00为阴性，1.001.10为可疑，比值在1.111.50之间为弱阳性，1.513.00为阳性，3.016.00为强阳性，6.00以上极强阳性。5.感染时间诊断：根据CMV-IgG和CMV-IgM检测结果诊断。CMV-IgM阴性且CMV-IgG阳性标本为既往感染组，CMV-IgG阳性且CMV-IgM弱阳性标本为继发或再感染标本，CMV-IgG阳性且CMV-IgM阳性标本为可疑原发感染，CMV-IgG阳性且CMV-IgM强阳性或极强阳性标本作为原发感染。6.统计学处理：采用SPSS 10.0软件，两组间比较采用t检验。结 果一.检测CMV-IgG含量的标准曲线标本品(补充品)浓度与OD值相关系数= 0.989，见图1。图1 CMV-IgG含量测定标准曲线 二、CMV-IgG AI值比较既往感染组与原发感染组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，既往感染组与其它2组比较，差异无统计学意义(P>0.05);继发或再感染组与可疑原发感染组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，继发或再感染组与原发感染组比较，差异有统计学意义(P<0.01);可疑原发感染组与原发感染组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。表1 4组CMV感染标本CMV-IgG AI测定结果三、检测CMV-IgG AI作为原发与非原发CMV感染的灵敏度和特异度随着灵敏度的增高而特异度下降，以灵敏度和特异度均为50.0 %时可用度为0计算不同判断标准时的可用度，当以35.0 %作为判断标准时该方法的可用度为67.2 %，而当用30.0 %作为判断标准时该方法的可用度为64.9 %，二者比较，差异无统计学意义(P>0.05)，35.0 %作为判断标准较好，灵敏度为75.0 %，特异度为91.4 %，见表2。表2 不同判断标准下CMV-IgG AI检测方法的灵敏度和特异度比较讨 论孕妇CMV感染可引发宫内感染，导致胎儿多种严重损伤，引发婴儿智力迟钝，是影响中国出生人口素质的主要因素之一。CMV感染途径复杂不易控制，到目前为止尚无可实际应用的有效疫苗进行预防和有效的药物治疗，而且孕期感染对胎儿的损伤是不可逆的，出生后治疗意义不大。因此，积极预防和减少先天性CMV感染儿的降生对提高中国出生人口素质具有重要意义。尽管孕妇CMV继发或再发感染以及原发感染都可能伤及胎儿，但是无论从胎儿感染率及胎儿伤害程度来看，原发感染都要比继发或再感染严重的多10。因此，在孕期正确诊断孕妇原发感染是预防先天性CMV感染儿降生最重要的措施。随着分子生物学技术的飞速发展，近年来有不少新的诊断方法用于CMV感染的诊断，如CMV短时培养快速诊断技术、抗原血症检测CMV pp65抗原、CMV病毒核酸检测、CMV mRNA检测等11，12，尽管这些方法在诊断CMV活动性感染方面比检测CMV-IgM更有优越性，但仍不能从活动性CMV感染中区别是原发感染还是继发或再感染，而在CMV活动性感染诊断基础上，通过检测CMV-IgG AI则是区分原发与非原发感染的最好方法之一58，而且方法简便，易于在各级医院或计生部门推广应用。在IgG AI检测中，常规是应用尿素洗涤孔OD值与PBST洗涤孔OD比值进行AI计算，但有学者发现这种常规方法虽然有简便的优点，但结果不够确定，因为AI的变化取决于检测每孔标本中的IgG抗体总量。Jenum等13采用终点法测定AI，但方法较麻烦，需要将待测标本作成不同的稀释度进行检测。Prince等14采用标准曲线定量测定方法，效果优于OD值计算，本文研究也证实了这点。尽管在CMV活动性感染的基础上检测CMV-IgG AI是一种简便、有效的区分原发与非原发感染的有效方法，但是Lazzatto等15发现通过IgG-AI检测对某些原发感染也有漏诊，因此有学者建议最好将IgG-AI与CMV中和抗体进行联合检测16，效果更好。Sipewa等17发现检测CMV-IgG AI排除新近原发感染的能力为84.0 %，若与中和抗体(抗CMVgB抗体)联合检测其排除新近原发感染能力提高到94.0 %。本文由于CMV原发感染血清标本收集困难，仅有8例，数量较少，因此，文中所得结论仅供参考，当待扩大样本测定证实后方可用于临床实践。【参考文献】 1Revello M G, Gerna G. 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