用MTT法进行白血病体外药物敏感性检测的临床意义.doc

用MTT法进行白血病体外药物敏感性检测的临床意义【摘要】 目的 探讨使用MTT比色法进行白血病体外药物敏感性检测的可行性，为MTT法作为肿瘤药敏检测技术应用于临床提供理论依据。 方法 采用MTT比色法测定47例血液病患者外周血和骨髓白血病细胞对14种临床常用化疗药物的敏感性，并与化疗药物的实际疗效作对照。 结果 47例患者中，体外敏感/体内敏感（S/S）30例、体外敏感/体内耐药（S/R）7例、体外耐药/体内耐药（R/R）9例、体外耐药/体内敏感（R/S）例；体外药敏与体内疗效的总符合率为82.98%，阳性符合率为81.09%，阴性符合率90%。敏感度96.77%，特异度56.25%。 结论 采用MTT法预测化疗药物的敏感性，临床相关性好。 【关键词】 白血病； 比色法； 氮蓝四唑； 药物耐受性； 药物筛选试验，抗肿瘤化学治疗是白血病的最主要治疗方式，由于肿瘤细胞的异质性和患者的个体差异，同一类型血液病的不同患者对化疗药物的敏感性各不相同，甚至同一患者在不同的化疗阶段对同一种药物的敏感性也有差异，血液病患者原发性耐药的情况也时有发生。若可在化疗前预测患者对药物的敏感性，针对不同的患者采用个案化化疗方案，必将有效的提高临床化疗的有效性和经济性。MTT法是一种体外药敏检测方法，具有快速、简便、灵敏、成功率高的特点1。笔者采用MTT法测定47例白血病患者白血病细胞体外对14种化疗药物的敏感性，研究体外药敏实验结果与体内敏感性的相互关系，以期为MTT法应用于临床指导合理用药提供理论依据。 1 对象和方法 1.1 对象 2007年10月-2008年9月本院血液科的复发（32例）和初治（15例）急性白血病患者，男性24例，女性23例，年龄中位数37岁(1674岁）；其中急性淋巴细胞性白血病（ALL）21例，急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）26例。所有白血病患者均按临床表现、骨髓形态学检查、免疫学分型和染色体检查确诊。当幼稚细胞数>30109L-1时取外周血、<30109L-1时取骨髓作为检测标本。标本用50 IU/mL的肝素钠抗凝。 1.2 仪器和试剂 二甲基噻唑烃基二苯四唑溴化物（MTT）购自美国Sigma公司，用生理盐水配成5 mg/mL，备用。淋巴细胞分离液（比重1.077）购自中国医学科学院生物工程研究所；RPMI1640购自美国GIBCO公司；ELX800型酶标仪购自美国BIOTEK公司。 1.3 化疗药物及其浓度 所有药物按说明书选用规定的溶媒溶解成工作液，终浓度采用化疗药物临床使用剂量在体内的血浆峰浓度2。药物浓度及厂家分别为:(1)高三尖杉酯碱（H）0.06 g/mL（杭州民生药业集团公司，批号：0801219）；(2)甲氨喋呤（MTX）20 g/mL（江苏连云港恒瑞医药股份有限公司，批号：07120812）；(3)盐酸阿糖胞苷（Arac）25 g/mL（哈尔滨博来制药有限公司，批号：080406）；(4)硫酸长春地辛（VDS）0.8 g/mL（杭州民生杭州民生药业集团公司，批号：0803069）；(5)硫酸长春新碱（VCR ）2 g/mL（深圳万乐制药厂，批号：0802V2）；(6)盐酸柔红霉素（DNR）0.4 g/mL（深圳万乐制药厂，批号：0710F1）；(7)盐酸表柔比星（EPI）5 g/mL（辉瑞制药厂，批号：0801012）；(8)盐酸阿柔比星（ACM）0.4 g/mL（深圳万乐制药厂，批号：0709B1）；(9)盐酸多柔比星（ADM）10 g/mL（深圳万乐制药厂，批号：0801E1）；(10)盐酸米托蒽醌（MIT）0.25 g/mL（江苏奥赛康制药有限公司，批号：070901）；(11)盐酸吡柔比星（THP）0.8 g/mL（深圳万乐制药厂，批号：0801C2）；(12)依托泊苷（VP16）62.5 g/mL（江苏连云港恒瑞医药股份有限公司，批号：08013131）；(13)盐酸依达比星（IDA）8.02 g/mL（意大利法玛西亚普强公司，批号：7QG004W）；(14)盐酸福达拉滨(Fludara)160.6 g/mL（意大利拜耳医药保健有限公司，批号：265A）。 1.4 方法 1.4.1 MTT法药敏实验 采用比重为1.077淋巴细胞分离液从样本中分离淋巴细胞，PBS清洗2次，弃上清，用完全培养液调整细胞浓度，接种于96孔板，每孔90 L，使细胞数为每孔（12）105个，设空白组、对照组、用药组；用药组加10 L化疗药物工作液，对照组只加细胞不加化疗药，空白组只加培养液。每组复种3孔，在37 、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养7296 h，每孔加20 L MTT溶液，48 h后每孔加100 L 10%十二烷基硫酸钠，18 h后用酶标仪测定570 nm处吸光度值（D值）。 1.4.2 敏感性及吻合性判定标准 1.4.2.1 体外药物敏感性 用化疗药物对细胞的抑制率表示，抑制率>30%为体外敏感。 抑制率=1-（D用药组-D空白组）/（D对照组-D空白组）100% 1.4.2.2 体内疗效 参照文献34疗效标准。（1）ALL：体内疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、未缓解(NR),其中CR或PR为体内敏感，NR为体内耐药。（2）ANLL：为诱导缓解治疗2个疗程内CR或PR者视为体内敏感，2个疗程NR者，第1疗程停化疗药后骨髓白血病细胞最低时下降指数(MBDI)60%为体内敏感，<60%为体内耐药。 MBDI=（化疗前骨髓白血病细胞数-停止化疗后最低时骨髓白血病细胞数）/化疗前骨髓白血病细胞数100% （3）敏感性 参照文献5，将体内外实验结果与临床疗效的关系分为：真阳性(体内/体外均敏感，S/S)，即体内使用1种或2种体外敏感药物获得CR或PR；真阴性(体内/体外均不敏感，R/R)，即体外药物不敏感，体内使用为NR；假阳性(S/R)，即体内使用1种或2种体外敏感药物未获CR或PR；假阴性(R/S)，即体内使用体外不敏感药物获得CR或PR。 总符合率=(S/S+R/R)/总例数100% 阳性符合率=(S/S)/(S/S+S/R)100% 阴性符合率=(R/R)/(R/R +R/S)100% 敏感度=(S/S)/(S/S+R/S)100% 特异度=(R/R)/(R/R+S/R)100% 1.5 统计学处理 化疗药物的抑制率以xs表示。不同类型急性白血病吻合度的比较采用2检验。 2 结 果 2.1 14种化疗药物对ALL和ANLL白血病细胞的体外抑制作用 在设定的药物浓度中，根据平均抑制率的大小由高到低依次为：（1）ALL对化疗药物的敏感性：多柔比星、伊达比星、氟达拉滨、表阿霉素、吡柔比星、米托蒽醌、高三尖杉、阿糖胞苷、柔红霉素、依托泊苷、长春新碱、长春地辛、阿柔比星、甲氨喋呤；其中多柔比星的作用最强（平均抑制率65.81%），其次为伊达比星（平均抑制率为62.21%）。（2）ANLL对化疗药物的敏感性：多柔比星、伊达比星、表阿霉素、氟达拉滨、阿糖胞苷、吡柔比星、高三尖杉、米托蒽醌、依托泊苷、柔红霉素、阿柔比星、甲氨喋呤、长春地辛、长春新碱；其中多柔比星的作用最强（平均抑制率60.87%），其次为伊达比星（平均抑制率为55.61%）。具体数据见表1。表 1 14种化疗药物对ALL 和ANLL白血病细胞的体外抑制作用 2.2 体外敏感与体内疗效的关系 47例患者中，S/S 30例、S/R 7例、R /R 9例、R/S 1例，体外药敏与体内疗效的总符合率82.97%，阳性符合率81.09%，阴性符合度90%。敏感度96.97%，特异度56.25%。 2.3 各型白血病体外药敏与体内疗效关系 ANLL体外药敏和体内疗效的吻合度为76.92%，ALL的吻合度为85.71%；不同类型急性白血病的吻合率差异无统计学意义，与总吻合度差异也无统计学意义（表2）。表2 ALL 和ANLL白血病细胞体外药敏与体内疗效的关系 3 讨 论 临床上白血病的化疗主要是根据循证医学的研究结果或凭经验采用较为固定的化疗方案，但是不同个体对不同化疗药物的敏感性各不相同6，使得目前临床上化疗的效果并不尽如人意。据统计，常用的抗肿瘤化疗药物对患者治疗的有效性<70%，而且由于缺乏化疗药物个体化治疗的遗传学分析，使20%40%的患者甚至有可能接受了错误的药物治疗7。因此，如何有效的预测个体对化疗药物的敏感性，已经成为提高化疗效果，减少多药耐药性产生的当务之急。 MTT法是根据活细胞的线粒体中脱氢酶系将四唑盐还原成不溶性蓝紫色的甲臜，从而测定药物作用下的活细胞数量。该方法于1991年被美国国立癌症研究所（NCI）纳入抗癌药物筛选程序8。由于MTT法应用于肿瘤药物敏感性检测在方法学上尚无国际统一的技术顺序，各机构采用的药物浓度、药物与细胞作用时间的选择及敏感标准的设立标准各不相同，加上MTT法所需细胞数量大，测定结果受酶标仪操作人员熟练程度等因素的影响，各机构检测结果的临床吻合度和敏感性各不相同，这也限制了该方法在临床的扩大开展。据报道，体外药敏测定结果与临床疗效总符合率可在74%90%9。 近年来，随着细胞提纯和原代培养技术的发展，采用MTT法进行肿瘤药敏检测体内外的吻合度也有了大幅度的提高。翟晓波等报道，采用MTT法进行肿瘤药敏检测对急性白血病的阴性符合度可达100%10。Sargent等经过多年对MTT法的研究应用，认为该方法结果与化疗敏感和耐药有显著的一致性，总吻合度可达到能为临床个体化选择化疗药物提供相对准确的依据11。本检测结果证明，体外药敏实验对血液病体内治疗效果具有较高的预示价值；不同急性白血病类型的吻合率不存在显著性差异（P>0.05），与总吻合度也不存在显著性差异（P>0.05），说明MTT法对不同类型的急性白血病其测定效率是相同的。结果还显示，药物抑制率的方差较大（表1），表明除实验误差因素外，不同个体对同种药物的敏感性表现出明显的差异。说明用MTT比色法进行肿瘤药敏实验具有较高的临床应用价值。 笔者认为，MTT法是一种较为可靠、适用于急性白血病的体外药敏检测方法，该方法阴性预告准确可以有效的避免临床的错误用药，减少不必要的浪费和多药耐药性的产生，因此MTT法可以应用于临床检测以协助医生制定个案化的化疗方案。但MTT法在实际应用中仍存在一定的局限性，如该方法只能测定药物细胞毒性，而无法预测药物的诱导凋亡或诱导分化作用。因此，如能将MTT法与细胞凋亡或诱导分化检测技术如流式细胞检测方法联合应用于肿瘤药物敏感性检测，必然会提高实验结果的可靠性，将更有益于MTT法在临床的扩大应用。【参考文献】 1 Burton J D. 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