蛋白诱导表达2011年分子生物学实验.ppt

2011年分子生物学实验 考 试 安 排,科 学 素 质：10% 实 验 操 作：20% 实验结果与报告：40% 实验原理与理论：30%,科 学 素 质,课堂提问 原始实验记录 团队合作 课堂纪律,仪器、用具的使用 台面整洁 考勤 卫生值日,实 验 操 作,1、根据老师的平时观察， 2、通过一学期的强调与要求，以最后两次实验的操作为主要评分依据。,实验结果与报告,根据个人所有实验的结果与实验报告的评分，取平均分。,实验原理与理论,考试时间：第13周（5月16日-20日） 考试地点：本教室 考试形式：每个同学按学号单独考试，抽签题目（1+2），口述回答问题，由老师和助教评分。 考试内容： 1、实验原理步骤：分子克隆总流程+10次实验原理步骤（共11个题，抽其中1题详细回答） 2、实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事项，理论知识，操作要点等。（抽其中2题简要回答）,实 验 九,蛋白质的诱导表达,背景理论知识,Section 1,9.1.1 实 验 目 的,掌握蛋白质诱导表达的原理 学习蛋白质诱导表达的方法 了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点,外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品,需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞,基因工程的最终目的,主要步骤 制备表达载体 制备目的DNA 将目的DNA 克隆到载体上,操作 1. 酶切, 去磷酸化 2. 胶回收纯化 1. 质粒纯化/PCR 2. 酶切 3. 胶回收纯化 1. 目的片断与载体连接 2. 转化非表达型宿主菌 3. 筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒提取酶,测序确定阅读框,蛋白表达操作流程,转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白,1. 转化带有T7RNA 聚合酶基因 的菌株 1. 检测质粒稳定性 2. 确定表达时间和温度的最佳条件 3. 分析蛋白溶解性和活性 4. SDS-PAGE, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化 4. 切除融合标签并去除蛋白酶,蛋白质表达系统,原核表达系统,真核表达系统,大肠杆菌,枯草芽胞杆菌,YEAST,CELL CULTURE,INSECT CELL,TRANSFERRED GENE,简单,便宜,大量,无修饰,复杂,昂贵, 有修饰,大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。,9.1.2 原核表达的特点,细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子 真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA, 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏 缺乏翻译后加工体系 不溶性的包涵体,在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大 目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导 充分诱导: 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, 数小时后达细胞总蛋白的50%以上 非诱导条件下: 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录,结构基因：编码-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。 操纵子：包括启动子、操纵基因和结构基因 调节基因、阻遏蛋白 乳糖+阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状。,9.1.3 乳糖操纵子,9.1.4 诱导原核表达的原理,E.Coli BL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的噬菌体，其基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5,lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。,9.1.5 蛋白原核表达载体,具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列，可供筛选的遗传性状，MCS 还必须具有用于外源基因表达的启动子、SD序列、及转录终止子等元件。 pET系列：6 His Tag （660Da-2kDa） pGEX系列：GST （26kDa） pMAL系列：Maltose Binding Protein （52kDa）,pET系列,pGEX系列,pMAL系列,9.1.6 融合蛋白,融合蛋白: 将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接, 融合阅读框表达出一杂合蛋白 融合标签: 1. 保护目的蛋白使之不被降解 2. 用于检测和纯化目的蛋白 3. 增加目的蛋白在细胞质中的可溶性 4. 帮助将目的蛋白运转到细胞周质中 以提高其生物活性,9.1.7 阅读框架的保证,pGEX系列,DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。 影响转录水平的因素：强启动子，强终止子 等。 影响翻译水平的因素：SD序列，mRNA稳定性等。 影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。,9.1.8 影响表达效率的主要因素,9.1.9 优化表达 （1）,增加蛋白质溶解性及折叠: 温度: 37 C 蛋白质以聚集的形式表达-包涵体 30 C 可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位: 有利于蛋白折叠及二硫键的形成 稀有密码子: 多数氨基酸都有一个以上的密码子, 但有一些 E.Coli很少 使用, 当异源目的基因的mRNA过表达时, tRNA 的数量直接 反应密码子的偏倚性, 一个或多个tRNA的稀有或缺少会导 致翻译的停止 毒性基因和质粒稳定性: 抗生素的使用 补充葡萄糖,提高翻译水平： 调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变碱基、增加mRNA稳定性 减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。 提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢负荷、恢复天然构象）,9.1.9 优化表达 （2）,实验操作,Section 2,9.2.1 实验器材,1、基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-eGFP 每位同学（20ml菌液/三角瓶） 2、IPTG （乳糖结构类似物） 3、LB(Kanr) 4、离心机,9.2.2 实验步骤(1),原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中。 挑取单菌落于2mL Kan+ LB培养基培养过夜。（已做） 以5%的比例转接于20mL Kanr LB培养基中，培养约1小时至OD600=0.6，即可开始诱导目的蛋白的表达。 取1mL菌液,制样作为未诱导对照。 三角瓶中加入IPTG 40uL(0.5M)至终浓度为1mM，继续培养。,取样：分别于培养后，30, 60，90, 120, 取1mL菌液制样。 制样： 12000rpm离心1min，去掉上清。 加入25uL ddH2O，重悬(充分分散细胞)。 加入25uL 2SDS凝胶加样缓冲液，混匀。 沸水浴5min(蛋白质变性)，取出后立即置于冰上。 冷却后，冰箱冷藏, 备用。,9.2.2 实验步骤(2),实验关键点,诱