胃肠外营养添加精氨酸对结直肠癌术后患者细胞免疫功能的影响.doc

胃肠外营养添加精氨酸对结直肠癌术后患者细胞免疫功能的影响【摘要】 目的：探讨胃肠外营养(TPN)添加精氨酸(Arg)对结直肠癌患者术后淋巴细胞免疫功能的影响及临床意义。方法：对56例结直肠癌患者术后进行了TPN支持的前瞻性研究，检测无脂TPN、常规TPN和常规TPN中添加Arg营养支持前后患者外周血的T淋巴细胞亚群（CD4+和CD8+T细胞亚群）和NK细胞百分比的变化以及外周血中IL2、IL4以及IFNr水平的变化。结果：无脂TPN、常规TPN支持前后患者外周血的CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞水平无明显变化，IL2、IL4以及IFNr水平无明显变化；常规TPN中添加Arg营养支持后患者外周血的CD4+和NK细胞百分比明显增加，CD8+T细胞亚群明显减少，CD4/CD8比值也较术前明显升高，外周血中IL2、IL4以及IFNr水平明显增加。结论：常规TPN不能纠正结直肠癌患者术后的细胞免疫抑制状态，但TPN添加Arg则可促进CD4+的Th1细胞亚群和NK细胞增加，外周血IL2和IFNr生成增加，提示TPN添加Arg对结直肠癌患者术后的细胞免疫有上调作用。 【关键词】 胃肠外营养 精氨酸 结直肠癌 免疫功能 The influence of total parenteral nutrition added with arginine on cellular immune function of colonic cancer after operation Abstract Objective:To explore the influence of total parenteral nutrition(TPN) added with arginine on the cellular immune function of colonic cancer after radical operation.Methods: There were 56 cases of colonic cancer supported with TPN who were divided into 3 groups (TPN without fat, routine TPN and TPN added with arginine), whose data were designed and analysed prospectively. The percent of T lymphocyte subpopulation and national killer cell (NK) in peripheral blood was detected, and so was the level of IL2, IL4 and IFNr in peripheral blood. Results: There was no marked change about CD4+ T cell, CD8+ T cell and NK in peripheral blood after TPN without fat and routine TPN, and so was the level of IL2, IL4 and IFNr. After TPN added with arginine, there was significant increase of CD4+ T cell, the ratio of CD4+ T/CD8+T and NK in peripheral blood, and so was the level of IL2 and IFNr. On the contrast, the percent of CD8+ T cell and the level of IL4 in peripheral blood decreased significantly after TPN added with arginine. Conclusion: Routine TPN can not correct the cell mediated immunity suppression after radical operation of colonic cancer. But TPN added with arginine can augment the percent of Th1 subpopulation and NK, and increase the level of IL2 and IFNr in peripheral blood, which denote that arginine can upregulate the cell mediated immunity of colonic cancer after operation. Key words Total Parenteral Nutrition；Arginine；Colonic Cancer；Cell Mediated Immunity 精氨酸(arginine, Arg)是人体半必需的二元氨基酸，同时Arg亦是一种具有免疫调节作用的小分子化学物质，具有内分泌促分泌功能1。另外，Arg可以在体内转换生成瓜氨酸和一氧化氮（NO），通过上述两个机制来发挥免疫上调作用2, 3。我们在结直肠癌患者术后的胃肠外营养(TPN)中添加Arg，观察其对淋巴细胞免疫功能的影响，现报告如下。 1 对象与方法 1.1 研究对象：选择2001年1月至2006年6月我院胃肠外科收治并经结肠镜及病理学证实的56例结直肠癌患者，其中结肠癌32例，直肠癌24例。男38例，女18例，年龄3177岁，平均(56.45.6)岁，中位年龄55.5岁。 1.2 入选标准：56例患者均符合下列条件而被纳入本研究：肝肾功能正常，无伴随代谢性、感染性和肠道炎性疾病；未用类固醇激素和免疫抑制剂；无肠道外恶性肿瘤性疾病以及无化疗放疗史；临床病理分期为期的结直肠癌。所有患者在随机抽签分组进入本研究前，均予以知情谈话并征得同意。 1.3 分组：56例患者随机分为3组(拆信封法)：组(n17)，使用无脂TPN；组（n18），使用含MCT/LCT(中/长链脂肪乳剂)的TPN；组：实验组，n21，使用含MCT/LCT和Arg的TPN。3组患者在年龄、体重、术式及结直肠癌分期方面均相近，具可比性。组(空白对照组)：另随机选取年龄和性别相近的符合本研究入选标准的非免疫相关的胃肠道良性疾病患者共24例，测定其入院淋巴细胞免疫功能作为正常参照值。 1.4 静脉营养实验方法：3组患者术前均在医院固定膳食，于气管插管吸入加静脉复合麻醉下手术，术中经锁骨下静脉置放中心静脉留置导管。术后第1天经中心静脉留置管(44例)或经外周静脉(12例)行TPN支持治疗，共6 d。氮源为10%复方氨基酸(苏州，华瑞公司)；脂肪乳剂为10%和20% Lipofundin(Braun，德国)；糖为50%、10%和5%葡萄糖溶液；并补充足够维生素、电解质和微量元素，能量和氮量均按营养计算尺计算，热卡为125146 J/kgd，氮为0.200.25 g/kgd，脂肪乳剂占非蛋白热卡的35%40%4。LArg由上海生物化学制药厂提供，Arg为25 g/d。以上营养制剂以“全合一”方式混合于三升袋中，16 h内输完。分别于手术前1 d和术后TPN结束后第2天取患者外周空腹静脉血进行免疫检测。 1.5 检测指标和操作方法 1.5.1 外周血淋巴细胞亚群测定：FITC、PE和CY3标记的小鼠抗人T细胞表面分子CD4、CD8和自然杀伤细胞（nature killer, NK），表面分子CD11c单克隆抗体购自EB公司 ，按说明书如下操作。 无菌取静脉学2 mL，肝素抗凝处理，600 rpm离心10 min，弃上清，细胞团内培养液少于25 L。加入FITC或PE标记的CD80、CD86和CD11c等表面分子的单克隆抗体15 L，混合均匀，4下避光反应30 min。PBS洗涤2次后，弃上清，加入1 mL的1%甲醛，固定30 min。加样枪将荧光标记抗体结合的细胞加入BeckmanCoulter流式细胞仪的检测孔内，检测淋巴细胞CD4、CD8和CD11c等表面分子的表达以了解外周血内淋巴细胞的比例变化情况5。数据以表达率的95%可信区间作为衡量表达情况的标准。 1.5.2 外周血IL2、IL4以及IFNr含量测定：人IL2、IL4及IFN的酶联免疫法 (enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒购自EB公司，按试剂盒说明书如下操作。 外周血予以5000 rpm离心10 min后，吸取上清，4冰箱保存备检。用俘获抗体包被96孔板，4孵化过夜。吸干孔内液体，每孔加300 L洗涤液，共洗涤3次。每孔加200 L的Assay Diluent封闭，室温下孵化1 h。吸干封闭液后洗涤板孔。除空白孔外，分别将不同浓度（2倍连续稀释）标准品、待测血清加入相应的反应孔中（100 L/孔），每个标本设3个复孔。用封板胶纸封住反应孔，置37孵箱孵育2 d。重复吸干、洗涤板孔5次。除空白孔外，每孔加入抗体工作液100 L，用封板胶纸封住反应孔，置室温孵育1 h。重复吸干、洗涤板孔5次。除空白孔外，每孔加入酶结合物工作液100 L，用封板胶纸封住反应孔，置室温下孵箱孵育30 min。重复吸干、洗涤板孔7次。每孔加底物溶液100 L，室温下孵箱孵育15 min。每孔加终止液50 L。反应完毕后，即刻在酶标仪上读取样本孔及标准品孔的OD450nm值和OD570nm值，以二者差值和对应的细胞因子浓度的常用对数值，分别作纵、横坐标，绘制标准曲线，从标准曲线求出样本的细胞因子浓度6。 1.6 统计学处理 3组患者以及一组非结直肠癌住院患者的计量资料的描述采用均数标准差（s），组间均数比较应用独立t检验进行比较，予以t检验，计数资料采用单因素方差分析进行统计学比较，设定为0.05。所有数据均在计算机SPSS10.0统计软件上进行运算。 2 结 果 2.1 一般情况：56例结直肠癌患者均成功地实施了结直肠癌根治术，其中行右半结肠癌根治术21例，左半结肠癌根治术17例，Dixon术18例。1例Dixon术后吻合口漏，保守治疗后自愈，1例右半结肠癌根治术后发生切口感染，引流后二期愈合，术中及术后无其它并发症发生。常规行TPN监测，未发生代谢及导管并发症。6例患者术中输血治疗，输浓缩红细胞量均少于200 mL。 2.2 T淋巴细胞亚群变化：见表1。 经单因素方差分析，各组患者的CD4、CD8、CD4/CD8以及NK变化存在统计学差异（t2.96，P0.05）。 患者、组患者手术TPN后CD4、CD4/CD8、NK水平均较术前有所下降，但经配对t检验，下降无统计学差异（t1.50，P0.05）；、组患者手术TPN后CD8水平较术前无明显变化（t1.24，P0.05）；经配对t检验，组患者的CD4水平增加，增加存在统计学差异(t3.06，P0.05)，CD4/CD8比值也较术前明显升高(t2.32，P0.05)，NK百分比升高未达到统计学意义（t1.12，P0.05）。 与组相比，、以及组的术前CD4和NK水平均降低，经单因素方差分析，存在统计学差异(t2.42，P0.05)；组以及组患者TPN后CD4和NK水平仍低于组结果(t2.65，P0.05)，组患者TPN后CD4和NK水平和组相比，无明显统计学差异(t1.64，P0.05)。表1 4组患者淋巴细胞亚群变化 注：*和术前相比较，P0.05；*和组及组手术+TPN前后相比较，P0.05 2.3 外周血IL2、IL4以及IFNr水平变化：见表2。 经单因素方差分析，各组患者外周血IL2、IL4以及IFNr水平变化存在统计学差异（t2.59，P0.05）。 患者、组患者外周血IL2、IL4以及IFNr水平在TPN前后比较未发现明显变化，经配对t检验，变化无统计学差异（t1.15，P0.05）；组患者的外周血IL2与IFNr水平在TPN后明显增加，经配对t检验，前后存在统计学差异(t2.54，P0.05)，其外周血IL4水平有所下降，经配对t检验，前后存在统计学差异(t2.28，P0.05)。 与组相比，、以及组的外周血IL2与IFNr的术前水平均降低，IL4水平增加，经单因素方差分析，存在统计学差异(t2.72，P0.05)；组患者TPN后外周血IL2、 IL4以及IFNr水平和组相比，无明显统计学差异(t1.34，P0.05)。表2 4组患者的外周血IL2、IL4以及IFNr水平变化注：*和术前相比较，P0.05；*和组组及组术前相比较，P0.05 2.4 等级相关分析：见表3，4。 4组患者的外周血CD4百分比与IL2以及IFNr的水平呈正相关关系，与IL4的水平呈负相关关系；外周血CD8百分比与IL4的水平呈正相关关系，与IL2以及IFNr的水平呈负相关关系。表3 IL2、IL4以及IFNr与CD4+百分比的相关分析(TPN后) 表4 IL2、IL4以及IFNr与CD8+百分比的相关分析(TPN后) 3 讨 论 荷瘤患者免疫耐受现象的轻重和肿瘤的类型、恶性程度以及临床分期相关，而且和患者的基础免疫状以及营养状态亦很密切7。手术、放射治疗以及化学药物治疗是目前治疗恶性肿瘤的常规手段，这些方法的应用对机体的免疫更是雪上加霜，对于腹部肿瘤患者来说，行肿瘤根治切除术后710 d机体的免疫水平最低，其细胞免疫功能降低最为明显，术后第3周开始逐渐恢复，至第46周接近术前基础水平8。 目前的诊断技术尚不能确切知道患者在行根治性手术前有无潜在的远处转移，所以即使按照肿瘤手术规范行根治性手术后，仍有很大比例的患者出现远处复发或转移。理论上，正常的机体免疫监控和免疫杀伤效应能有效去除潜在的非灶性播散癌性细胞，而手术后免疫力的下降对潜在的肿瘤发展和扩散不能有效遏制，所以围手术期内采用适当方法提高患者免疫水平或促进患者尽快恢复免疫监视和保护水平很重要7, 9。 绝大多数结直肠癌患者根治性手术后需行一定时间的全胃肠外营养（TPN），常规的TPN支持并不能纠正创伤、应激以及组织低有效灌注量所致的细胞免疫抑制；而这一阶段的患者免疫水平和潜在肿瘤扩散和复发负相关5, 10。国内外研究发现，Arg既是人体代谢应激状态下的必需氨基酸，又具有正性免疫调节作用，能够改善肿瘤宿主的免疫耐受状态和逆转创伤及应激所致细胞免疫抑制状态1。Arg的免疫增强机理包括：（1）通过Arg酶的作用生成一氧化氮（NO），NO能参与到骨髓和淋巴组织产生淋巴细胞以及促进分泌细胞因子，促进扩增 Killer Tcells 免疫杀伤细胞，活化后能对肿瘤细胞进行特异性杀伤效应2。（2）精氨酸是一种潜在的内分泌促分泌物质，能刺激B淋巴细胞和T淋巴细胞分泌细胞因子和辅助其免疫杀伤效应3。（3）精氨酸可诱导多能干细胞向原始免疫效应细胞定向分化，扩增免疫细胞库11。（4）在淋巴细胞受到“异己”成分激活后，在产生IL2和IFN的过程中，绝对需要精氨酸6。（5）经静脉摄入鸟氨酸能提高外周血液中B淋巴细胞的IgM和IgG的产量1。（6）精氨酸能降低CD8T细胞的数量和提高了CD4CD8的比率，补充精氨酸后虽然T细胞的绝对数量没有提高，但细胞表达 CD56、CD8CD56和CD8CD11b表型增加，提示免疫效应细胞的活性大大增强11。（7）供给足够数量的精氨酸能提高自然杀伤细胞和巨噬细胞的活性，进而诱导淋巴因子激活杀伤（LAK）细胞的活化2,9。 研究表明：有腹腔感染的动物在输入Arg后可增加其存活率2，并改善其淋巴细胞免疫功能2, 11；在没有其它影响因素时，小鼠接种致瘤病毒后，静脉添加精氨酸能提高潜伏时间、减少肿瘤的尺寸和缩短肿瘤倒退的时间；在转移肿瘤模型中，精氨酸可抑制肿瘤的生长速度和提高小鼠感染中性和弱性激发免疫应答；亦发现精氨酸能提高淋巴细胞一肿瘤混合培养基中宿主的反应性12。在外科试验者中，精氨酸可阻止外科手术病人的T淋巴细胞数量降低1,9。 据研究，过多的长链脂肪酸可能抑制淋巴细胞功能3,13。我们的研究发现，无脂TPN和MCT/LCT的TPN对术后的细胞免疫无明显的进一步抑制作用，而TPN添加Arg支持后，患者的CD4、CD4/CD8比值以及NK细胞上升，说明结直肠癌患者术后行添加Arg的TPN营养支持治疗，能在一定程度上缓解术后细胞免疫抑制状态和恢复细胞免疫功能的作用。 应用Th细胞克隆培养技术并根据细胞因子产生的不同，CD4+的辅助T淋巴细胞（T helper, Th）可分为Th1和Th2亚群，其区别在于Th1诱导CTL的产生以及分泌IL2、TNF、LT以及IFN等相应细胞因子，提升抗肿瘤免疫效应；而Th2亚群分泌IL4和IL10为代表的细胞因子，参与免疫抑制或免疫耐受14。在身体内，Th1和Th2亚群以及相应的细胞因子的此消彼长往往意味着机体免疫状态变化，Th1及IFN等细胞因子的增加意味着机体免疫上调，发挥抗肿瘤免疫作用；而Th2亚群及IL4和IL10等因子的增加往往意味着免疫耐受或者免疫下调6, 14。抗原激活CD4+的Th1亚群进而产生针对特定肿瘤的特异免疫杀伤是完成免疫治疗的最后一个环节，也是衡量免疫疗效的标准2, 11。我们把IFN、IL2和IL4作为效应细胞因子，运用ELISA检测方法，对外周血中相应因子进行了定量检测，研究发现：添加Arg的TPN后IFN、IL2水平上调，而IL4下调，提示患者免疫状态上调。该结果提示添加Arg的TPN促进了体内同源淋巴细胞活化，诱导分泌IFN等细胞免疫上调因子的Th1增加，而分泌IL4等细胞免疫下调因子的Th2亚群相对减少，这意味着机体免疫水平上调，一定程度上消除了免疫抑制或免疫耐受状态。 另外，Arg可通过促进IL2生成增加，提高NK和LAK细胞活性2, 9。本研究中，TPN添加Arg支持后患者的IL2水平则有明显增加，与NK细胞活性呈显著正相关，因此，我们认为Arg对术后创伤应激所致细胞免疫功能抑制的逆转作用，另一个通路可能是通过IL2对NK细胞的促进作用而起效的。 总之，精氨酸具有正性调节机体免疫水平，能逆转肿瘤患者的免疫抑制状态，对于正规抗肿瘤治疗具有一定的辅助作用。【参考文献】 1薛平慧, 刘 君. 精氨酸强化的肠内营养对消化道肿瘤术后机体免疫及炎性反应的影响. 临床外科杂志,2006，14(4):212214.2彭 曦, 尤忠义, 汪仕良. 精氨酸对机体免疫功能的影响及临床应用研究进展. 中国临床营养杂志, 2005，13(6):388390.3刘 东, 李德天, 孙广平. 氯沙坦对抑制一氧化氮合酶Heymann肾炎大鼠的肾脏保护作用. 中国医科大学学报,2005，34(5):416417.4Docknascimento DB, Tavares VM, Deaguilar JE. Evolution of nutritional therapy prescription in critically ill patients. Nutr Hosp,2005, 20(5):343347.5Yang SC, Hillinger S, Riedl K, et al. Intratumoral administration of dendritic cells overexpressing CCL21 generates systemic antitumor responses and confers tumor immunity. Clin Cancer Res,2004,10(8):28912901.6IchiyamaT, Siba P, Suarkia D, et al. Analysis of serum and cerebrospinal fluid cytokine levels in subacute sclerosing panencephalitis in Papua New Guinea. Cytokine,2006,33(1):1720.7Muller AJ, Scherle PA. Targeting the mechanisms of tumoral immune tolerance with smallmolecule inhibitors. Nat Rev Cancer,2006,6(8):613625.8Decker D, Tolba R, Springer W, et al. Abd