COS7细胞冻存和复苏传代培养.ppt

COS7细胞冻存和复苏传代培养 郭美琼,指导老师 陆家海 欧阳丽萍,研究目的,建立CoS-7细胞培养的方法 观察COS7细胞培养的特点 了解COS7细胞的用途,建立CoS-7细胞培养的方法,主要阐述CoS-7细胞培养的体系,观察COS7细胞培养的特点,是贴壁细胞还是悬浮细胞？细胞培养过程中形态的变化，分裂生长的形式等,了解COS7细胞的用途,COS-7细胞的来源、特性及生命医学用途：,小结,COS7细胞(猴细胞的一种细胞系)为重组病毒的宿主细胞，是表达SV40大T抗原的非洲绿猴肾细胞株，能支持部分突变型SV40和含SV40 ori的质粒载体的复制,可高水平表达外源基因，常作为瞬时表达宿主。故本实验建立COS7细胞的冻存和复苏传代方法。,（一）实验材料 1 细胞株 cos7细胞株 2 试剂 RPMI-1640培养基小牛血清（NBS）N-(2-羟乙基)-哌嗪-Ng-2（丙磺顺酸）（Hepes，Sigma公司产品）胰蛋白酶碳酸氢钠以及链霉素和青霉素 3 实验准备,1 培养液的配置 1 (1) RPMI-1640液：1640粉2袋Hepes 2.14g碳酸氢钠4.0g加水至2000ml调至PH=7.15，过滤。 1 (2) 1640完全培养液：10小牛血清双抗（含链霉素、青霉素）的1640培养液，4保存。 1 (3) 10%DMSO冻存液的配置：1份DMSO3份小牛血清6份完全培养基 1 (4) 胰蛋白酶1.25gEDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.10g于烧杯中先用少许PBS调成糊状，再补充PBS至500ml，搅拌混匀4小时后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。,2 Cos7细胞冻存方法 2 （1） 取对数生长期的细胞，收集细胞前换液一次。 2 （2） Cos7细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，1200转/分离心1分钟，去上清。弹指法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴加入与细胞悬液等量的DMSO冻存液。 2 （3） 分装：细胞悬液分装在2 ml 冷冻管中，密封后标记细胞名称和冷冻日期。 2 （4） 梯度降温冻存：冷冻管置-20、停留12小时，再降至70过夜，投入液氮。,3 Cos7细胞复苏 3 （1） 将加有小牛血清双抗的1640完全培养液从冰箱取出，升至室温。 3 （2） 从液氮中取出冻存管，迅速投入3738水浴中，摇晃使其在1分钟左右融化。 3 （3） 转至EP管，加1640完全培养液至1.5 ml左右，吹打，1200转/min，离心3分钟。 3 （4） 去上清，再加1640完全培养液至1.5 ml左右漂洗，离心3分钟。去上清，加新鲜培养液吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液至总体积约4ml.，置温箱培养。,4 Cos7细胞传代 4 （1） 弃掉培养瓶内原来的培养液，加入57滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶底，吸出胰蛋白酶。 4 （2） 再加入810滴0.25%胰蛋白酶，将培养瓶置37、5CO2孵箱23min，观察细胞胞体回缩变圆,细胞接近脱离瓶壁时终止消化。 4 （3） 小心吸出并弃去胰酶，加入12ml1640完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细胞悬液，14传代。各瓶加入培养液2ml，放入37、5CO2培养箱继续培养。,二 结果,1 复苏细胞：第1d,镜下观察复苏细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第2d,复苏细胞镜下观察细胞大部分贴壁。第3d,复苏细胞镜下观察细胞增殖速度较快，折光性好。5d后可按比例传代。,2 传代细胞：第1d,镜下观察传代细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第2d,中,传代细胞镜下观察细胞已贴壁,折光性好,少数细胞出现伪足。第3d,传代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸出伪足,细胞轮廓清楚,折光性强,细胞数量明显增多。,3 传代细胞传至第68代仍保持增殖状态，细胞生长速度未见减慢,能长满瓶底。,三 讨论,1 养细胞维持传代以供实验用常遇到某些困难。首先，细胞株在传代中其性质发生变化。其次，在传代中有微生物污染的危险。解决这些困难的办法就是将细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时间几乎是无限的（因为在-130以下，所有的生化反应已停止，而液氮的温度在-150-160之间）,2 培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度过大，导致营养不良而引起细胞衰老停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行稀释再培养，即将培养瓶内的细胞分离稀释接种到新培养瓶内继续扩大培养。首次传代的细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新环境，以利于细胞的生存和增殖，通常原代细胞按1：2分种传代，细胞株按1：4分种传代,3 实验需严格遵守无菌操作规则，以减少操作引起的污染。一切操作，都要在火焰周围进行，瓶口、吸管等要经过火焰消毒。但用于吸取细胞培养液、小牛血清、酶液的吸管使用后不能在火焰上消毒，因为残留在吸管中的培养液烧焦炭化，再使用时会把有害炭化物带入培养液中毒害细胞。,4 实验完毕，关闭超净台鼓风机和电源，未使用器材放入饭盒内，用过的玻璃器材投入清水中浸泡，用酒精棉球擦拭工作台面。可减少培养液被微生物污染。,5 细胞冻存复苏的基本原则是慢冻速融,可最大限度的保存细胞活力。细胞直接冻存时,细胞内外的水分会很快形成冰晶,引起一系列不良反应。因而在冻存时尽可能地减少细胞内水分及冰晶形成,是保护细胞减少损伤的关键。目前多采用甘油和二甲基亚砜（DMSO）作保护剂,它们对细胞无明显毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降。通过缓慢冷冻,使细胞内水分尽可能多的渗出细胞外,减少细胞内冰晶形成。而复苏细胞时,采用快速融化,可保证细胞外结晶在很短时间内融化,避免缓慢融化使水分渗入细胞内形成细胞内再结晶。在本实验中,我们用二甲基亚砜作保护剂,经过两个低温梯度、过夜后移入液氮;融化复苏时在37、2分钟内完成,对细胞未造成明显损伤,复苏后细胞存活率可达90%,细胞形态、生长速率与未冻存细胞相比,未见明显差异,6 cos7细胞生长分为3期：延缓期、增殖期和停滞期.首次传代一般在Cos7细胞增殖早期,此时细胞刚刚度过延缓期,脆弱易损,首次传代对于Cos7细胞是否能长期存活尤为重要.而在Cos7细胞增殖后期,细胞贴壁紧密,消化时间不足,细胞不易从瓶壁脱落,不仅传代细胞数量少,影响实验的准确性,而且由于局部代谢物的积累,细胞即进入停滞期,若消化时间过长,待细胞完全从瓶壁脱落,则细胞膜已受损,死细胞增多.胰蛋白酶是常用的消化液,可使细胞脱离附着物表面和相互离散成单个细胞,但胰蛋白酶对细胞也有损伤可影响细胞活性5.本文建议采用0.25%胰蛋白酶在37,消化2min的参数。这是因为在37下胰蛋白酶活性最大,所需消化时间最短,可避免胰蛋白酶长时间作用于细胞造成细胞的损失。,7 本室探讨了37、CO2条件为培养Cos7细胞的适宜环境。因为刚复苏细胞增殖缓慢,自身调节pH的能力差的缘故，显示复苏细胞要在37、5CO2条件下培养才能顺利传代并保持较好的生长状态,参考文献 1 Gluzman Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell,1981,23:175182. 2 Sambrook J, Fristch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Har