实验四、五章大肠杆菌感受态的制备、质粒DNA的转化及转化子筛选概述.ppt

实验四、五 大肠杆菌感受态的制备、质粒DNA的转化及转化子筛选,一、实验目的,掌握利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态的原理； 掌握质粒DNA转化、转化子筛选的原理； 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。,一、实验原理,常用预冷的CaCl2处理细菌制备感受态细胞：用低温（0）低渗CaCl2溶液处理快速生长的细菌，即可获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。 在一定条件下，外源片段与感受态细胞混合、保温和热激，进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源分子的受体细胞。,二、实验所需器材和试剂,（一）仪器设备： 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。,（二）试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.100mM CaCl2溶液。 3.待转化质粒。,三、实验步骤,1.挑取一DH5单菌落于20ml LB培养液中37过夜培养 。,2.取其中800ul菌液于一含20mlLB培养液的锥形瓶，37振摇培养至OD600值达到0.4-0.6之间.,3.取1.5ml菌液置于离心管内，4 10000g离心1min，去掉上清。,4 10000g离心1min,4.加入1ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，反复吸打混匀，使细胞重悬，然后冰浴30min.,1ml 、100mM的冰冷CaCl2,5.4 10000g离心5分钟收集细胞，然后瞬时离心并去掉残液；最后，加100uL、100mM的冰冷CaCl2溶液，轻轻反复吸打悬浮细胞,冰上放置3-5min,即成感受态细胞悬液。,6.感受态细胞暂且不用时加入等V30%的甘油，贮存于-70可保存半年，取其中一份进行转化。,加入等V30%甘油,7.向转化管中加入1uL质粒DNA(不超过10uL),旋转3-5圈混合，最后于冰上放置30min。,8.将上述混合物转移到42的水浴锅中，热休克90s(不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1-2min。,9.向管内加入800ul的LB培养液。然后37培养45min-1h。,10.取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置15分钟.,11. 倒置平板于37 培养1216个小时。,四、实验注意事项,为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(