纳米TiO2影响成骨细胞矿化成熟的研究

单位代码 10006 学 号 10101022 分类号 毕业设计(论文)纳米TiO2影响成骨细胞矿化成熟的研究院（系）名称生物与医学工程学院专业名称生物工程学生姓名吴文毅指导教师王江雪2014年5月论文封面书脊论文题目姓名北京航空航天大学北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：纳米TiO2影响成骨细胞矿化成熟的研究 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：掌握细胞系传代培养技术及相关溶液的配制及高压灭菌方法，光学显微镜、分光光度计等基本仪器的使用，熟悉细胞样品的收集、保存方法，根据染色操作步骤及相关试剂盒进行检测和分析，掌握相关的统计分析软件等。、毕业设计（论文）工作内容：1、2014.2.15-2014.3.4：查阅文献，并完成翻译文献2万字。并在寒假期间完成，主要是为了熟悉课题相关内容，进行初步实验的设计; 2、2014.3.4-2014.3.15：MEM培养基和相关试剂的配置以及细胞实验的前期工作； 3、2014.3.15-2014.4.31：成骨细胞的传代培养，并观察细胞的形态和生长状况。细胞与纳米TiO2材料共培养； 4、2014.4.31-2014.5.23：细胞碱性磷酸酶染色：使用BCIP/NBT法检测纳米TiO2材料对细胞碱性磷酸酶的影响； 5、2014.5.23-2014.5.24: 数据整理和统计学分析并撰写论文。、主要参考资料：1 Akatsu T, Yamada Y, Hoshikawa Y, et al.Multifunctional porous titanium oxide coating with apatite forming ability and photocatalytic activity on a titanium substrate formed by plasma electrolytic oxidation.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2013 Dec 1;33(8):4871-4875.2 Victoria Frjd, Paula Linderbck, Ann Wennerberg,et al.Effect of nanoporous TiO2 coating and anodized Ca2+ modification of titanium surfaces on early microbial biofilm formation.BMC Oral Health 2011, 11:83 Yao,C Perla V ,McKenzie J L, et al.Anodized Ti and Ti6Al4V possessing nanometer surface features enhances osteoblast adhesion. Journal of Biomedical Nanotechnology,2005,1(1):68-734 Sato M,Aslani A,Sambito M A,et al;Nanocrystalline hydroxyapatite/titania coatings on titanium improves osteoblast adhesion.Journal of Biomedical Materials Research A,2008,84A(1):265-2725 Brammer K S,Oh S,Cobb C J,et al.Improved bone-forming functionality on diameter-controlled TiO2 nanotube surface.Acta Biomaterialia,2009,5(8):3215-32236 Zhao X, Wang G, Zheng H,et al.Delicate refinement of surface nanotopography by adjusting TiO2 coating chemical composition for enhanced interfacial biocompatibility.ACS Appl Mater Interfaces. 2013 28;5(16):8203-8209.生物与医学工程学院学院（系）生物工程专业类 101011 班学生 吴文毅毕业设计（论文）时间： 年月日至年月日答辩时间：年月日成 绩：指导教师：兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）：系（教研室） 主任（签字）：本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。作者：签字：时间：2014年 6 月北京航空航天大学毕业设计(论文)第19页纳米TiO2影响成骨细胞矿化成熟的研究学生：吴文毅指导老师：王江雪摘要钛及其合金具有比重小、弹性模量与人体骨组织较匹配以及优良的耐腐蚀性和生物相容性等优点，是目前应用最为广泛的生物医用金属材料，常用作人工骨、人工关节、种植牙、种矫形组件等。但相对人体组织而言，钛植入体仍然是外体材料，不能完全为人体接受，其生物惰性、金属离子的释放和磨粒的形成，都会影响到植入体的正常使用效果。因此，可对钛合金植入体进行表面改性来改善其表面理化性质，改善植入效果。在钛合金表面改造TiO2涂层是常用的表面改性手段。成骨细胞在骨形成的过程中发挥着重要的作用，是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。所以，探究TiO2对成骨细胞矿化成熟的影响可作为探究TiO2与骨组织相互作用的一部分，是有意义的。小鼠成骨细胞系MC3T3-E1具有极好的成骨分化潜能，血清和抗坏血酸即可刺激其向骨细胞分化。因此，本实验用MC3T3-E1 细胞系作为体外研究骨细胞增殖和矿化的细胞模型，在24孔板或者6孔板中用分化培养基将细胞与纳米TiO2材料进行一段时间的共培养之后，使用BCIP/NBT法检测纳米TiO2材料对细胞碱性磷酸酶的影响；采用茜素红染色法对成骨细胞矿化结节进行染色，在光学显微镜下进行计数，分析。得到的结果用来评估TiO2材料对成骨细胞矿化的影响。关键词：成骨细胞，钛，二氧化钛，矿化The research about nano-titanium dioxide affect osteoblast mineralization matureAuthor: WenYiWU Tutor: JiangXue WangAbstractTitanium and its alloys have a small proportion of the elastic modulus as compared with human bone tissue matching and excellent corrosion resistance and biocompatibility, etc., is currently the most widely used biomedical metallic materials, commonly used for bone, artificial joints, dental implants, and other types of orthopedic components.But relatively speaking human tissue, titanium implant material remains outside the body, the human body can not be fully accepted its biologically inert, forming a metal ion release and abrasive, will affect the normal use of the effect of the implant.Thus, the surface of titanium implant surface modified to improve its physicochemical properties, the effect of improving the implantation. TiO2 coatings on titanium alloy surface modification is a common means of surface modification.Osteoblast cells play in the process of bone formation in an important role in bone formation is a major function of the cells responsible for bone matrix synthesis, secretion and mineralization. Therefore, to explore the impact of TiO2 on into mature osteoblasts mineralization as part of TiO2 and explore the interaction of bone tissue, is meaningful.Mouse osteoblastic cell line MC3T3-E1 has excellent osteogenic differentiation potential, serum and ascorbic acid to stimulate their differentiation into osteoblasts.So, this experiment MC3T3-E1 cell line as a model for in vitro cell proliferation and mineralization, with differentiation medium will then co-cultured cells and nano-TiO2 material over time in 24-well plates or 6-well plates, using the BCIP / NBT assay nano TiO2 materials cell alkaline phosphatase; using alizarin Red staining on osteoblast mineralization nodules were stained for counting under an optical microscope analysis. The results are used to assess the impact of TiO2 materials on osteoblast mineralization.Key words: Osteoblasts, titanium,titanium dioxide,mineralization 目录摘要IAbstractII1绪论11.1 课题背景11.1.1 植入体与骨组织相接触11.1.2 成骨细胞在骨形成中的主要作用与特性21.2 课题的研究目的及意义31.3 课题研究现状42实验材料和方法62.1 MEM培养基和相关试剂的配置62.1.1 MEM 培养基配置62.1.2 含血清的MEM 培养基配置62.1.3 分化培养基配置62.1.4 PBS 缓冲液62.1.5 含EDTA的0.25% 胰酶的配制62.1.6 4%多聚甲醛的配置62.2 细胞复苏72.3 细胞传代72.4 纳米TiO2悬液制备72.5 细胞接种82.6 纳米TiO2材料悬液的制备82.7 纳米TiO2材料与细胞共培养82.8 碱性磷酸酶染色92.8.1 实验原理92.8.2 实验步骤92.9 茜素红染色法对成骨细胞矿化结节进行染色92.9.1 实验原理92.9.2 实验步骤103结果与讨论113.1 实验结果113.1.1 细胞与材料共培养的情况113.1.2 碱性磷酸酶染色情况113.1.3 茜素红染色情况133.2 实验讨论143.2.1 情况一：143.2.2 情况二：143.2.3 综合讨论：154实验结论165致谢176参考文献181 绪论1.1 课题背景钛及其合金具有比重小、弹性模量与人体骨组织较匹配以及优良的耐腐蚀性和生物相容性等优点，是目前应用最为广泛的生物医用金属材料，常用作人工骨、人工关节、种植牙、矫形组件等。据介绍,全球每年有超过1000吨的钛被用在各种医疗设备中，并植入患者体内，这是因为医学界普遍认为钛合金设备较耐腐蚀,是植入体内的良好材料。但相对人体组织而言，钛植入体仍然是外源性材料，不能完全被人体接受，其生物惰性、金属离子的释放和金属磨粒的形成，都会影响到植入体的正常使用效果。根据最新英国伯明翰大学等机构的研究人员的发表报告显示：钛合金设备植入体内后，仍可能存在被腐蚀风险，并且会引起发炎。因此，许多研究对钛合金植入体进行表面改性以其改善其植入效果及使用寿命。近年来，人们采用不同的表面改性手段对钛合金表面进行修饰，比如：采用气相沉积、喷涂、镀覆、电化学处理等纳米涂层的制造方法进行表面改性，改变医用钛和钛合金植入物表面的形态、化学成分、组织结构，可使基体的局部或整个表面的物理和化学性能得到提高。其中，在钛合金表面生成二氧化钛涂层是常用的表面改性手段，他们对钛合金表面的TiO2涂层也做了大量研究，比如：等离子体电解氧化（PEO）是用来制造在钛基底上一种多功能多孔二氧化钛（TiO2）涂层的方法。这种高结晶性的TiO2表面有助于磷灰石形成能力和光催化活性1；不仅如此，科学家还证明了溶胶 - 凝胶法制纳米TiO2涂层可以以提高人体软组织的附着，但他们对口腔细菌的粘附和生物膜形成的影响是未知的2。1.1.1 植入体与骨组织相接触植入体植入人体后与周围组织发生反应，最终形成植入体-骨界面，产生结合。植入体的成功主要取决于植入体-骨界面的形成。在植入体-骨界面形成的过程中，周围组织中的细胞迁移、贴附并生长到植入体表面对界面的形成至关重要。因此，纳米TiO2材料与骨组织接触并对成骨细胞产生的影响也是学界所关注的热点问题。比如：Webster研究小组发现将成骨细胞接种在TiO2纳米管处理的钛箔表面比未经处理的钛箔表面生长的成骨细胞更容易黏附。铺展合成并分泌碱性磷酸酶和胶原促进钙沉积3-4。Brammer等发现植入体表面的管状纳米TiO2的管径越大（100nm左右），成骨细胞的铺展能力越强，碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）的活性也越高。通过调整二氧化钛涂层的化学成分增强表面纳米形貌界面的生物相容性。在纳米TiO2涂层中加入适量的铌，相较于单纯的二氧化钛涂层，更能强化人成骨细胞在材料上的黏附，促进细胞增殖5。在-磷酸三钙（-TCP）和二氧化钛（TiO2）构建的陶瓷骨支架处，成骨标志物碱性磷酸酶活性很高。这些结果初步表明，-TCP/TiO2支架具有作为成骨活性的承重支架的良好潜力，这些支架可以增强体内的骨整合和促进形成新的骨组织，使得长骨再生仿生支架材料有了很大的进步6。也就是说，TiO2涂层有时可以促进成骨细胞的矿化成熟。具有纳米涂层的人工植入物置于此种生物环境中时，由于摩擦磨损和化学腐蚀将产生纳米级别的磨损颗粒。这些纳米磨损颗粒的尺寸小，比表面积较大，与器官接触的活性点增多，更容易在组织/器官内沉积，而不易被巨噬细胞清除，从而对植入区域周围的组织/细胞造成负面效应；并可能随体液循环分布至全身其他部位，进一步对各组织器官的功能造成不良影响16。1.1.2 成骨细胞在骨形成中的主要作用与特性成骨细胞是骨发生和骨形成的物质基础，是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。成骨细胞分泌几乎所有骨基质成分，合成并分泌骨基质（主要成分为I型胶原、糖蛋白、蛋白多糖等有机物质）；输送钙离子至类骨质，参与类骨质的钙化；释放的碱性磷酸酶能够水解对骨矿化有极强抑制作用的无机焦磷酸盐，使其浓度下降，从而使得骨矿化增强；在骨矿化期骨钙素高度增加，此后，骨钙素逐渐降低，与此同时，可观察到胶原酶增加，成骨细胞开始凋亡，并出现代偿性细胞增殖和胶原合成；通过调节钙、磷等离子浓度，可以增强骨钙化。典型的成骨细胞细胞周期时间为2024小时。抑制与细胞周期调节相关的基因会导致增殖的停止。体外培养的成骨细胞常采用小鼠成骨细胞系MC3T3-E1，MC3T3-E1具有极好的成骨分化潜能，血清、磷酸甘油和抗坏血酸即可刺激其向骨细胞分化7。此细胞系可长期保存，取用方便，目前有很多科研工作者使用MC3T3-E1细胞系作为体外培养成骨细胞进行与骨组织相关的研究，并取得了优良的成果。因此，MC3T3-E1 细胞系提供了一个非常方便的体外研究骨细胞增殖和矿化的细胞模型。1.2 课题的研究目的及意义二氧化钛（Titanium Dioxide，TiO2）是一种重要的半导体金属氧化物。在自然界中TiO2以锐钛矿型（Anatase）、金红石型（Rutile）和板钛矿型（Brookite）三种晶体形式存在，其中最为广泛使用的是锐钛矿和金红石两种。纳米材料具有小尺寸、大比表面积、量子尺寸效应及量子隧道效应等，并由此派生出传统固体不具有的许多特殊性质。将纳米材料与生物技术相交叉渗透产生的纳米生物技术，日益展现出广泛的应用和产业化前景，在诸如靶向定位药物、基因治疗、组织再生、医用材料的研制等方面凸显出其优势8。据介绍,全球每年有超过1000吨的钛被用在各种医疗设备中,并植入患者体内。这是因为医学界普遍认为钛合金设备较耐腐蚀,是植入体内的良好材料。但随着对钛合金医疗材料的研究的进展，越来越多的负面报道也渐渐被大家所知。比如：由于应力遮挡、摩擦磨损、化学腐蚀以及生物体特殊的微环境，具有纳米涂层的人工植入物将产生纳米磨损颗粒，这些纳米磨损颗粒的尺寸小，比表面积较大，与器官接触的活性点增多，更容易在组织/器官内沉积，而不易被巨噬细胞清除，从而对植入区域周围的组织/细胞造成负面效应，并可能随体液循环分布至全身其他部位,进一步对各功能组织器官功能带来不良影响。钛及钛氧化物材料作为植入体对于人体所产生的影响不容忽视。骨组织是人体最常见，也是最容易引起缺损的组织器官。现在，每年有数以百万计的骨组织缺损患者需要接受治疗。而钛及其相关衍生材料正是目前大量用来治疗骨组织疾病的材料，它需要植入患者体内才能发挥功能。而在它发挥功能时，对机体所带来的影响是非常重要的。定性和定量这些影响也是人们当下迫切需要知道的问题，因为这些数据直接指导了世界上钛医疗材料研发与生产的产业链，与全世界人类的骨安全息息相关9。本实验通过MC3T3-E1 细胞系构建体外研究骨细胞增殖和矿化的细胞模型。将纳米TiO2材料与细胞在分化培养基中进行共培养之后，使用BCIP/NBT法检测纳米TiO2材料对细胞碱性磷酸酶的影响；采用茜素红染色法对成骨细胞矿化结节进行染色，在光学显微镜下进行计数，分析。为纳米TiO2对成骨细胞矿化成熟的影响进行评估，进一步为纳米TiO2在生物医学工程领域的合理安全应用提供依据。1.3 课题研究现状国内的研究小组张金超等的研究结果表明：金纳米粒子能够促进MC3T3-E1 细胞的成骨分化及其矿化功能：由于纳米材料具有与骨中羟基磷灰石晶体和胶原纤维相似的尺寸10。因此推测, 与羟基磷灰石具有相似尺度的金纳米粒子可能扮演了一个晶核的角色, 从而刺激其周围细胞的增殖、分化和矿化，形成钙的沉积。而且，不同粒径的金纳米粒子对MC3T3-E1 细胞的增殖、成骨分化及其矿化功能的影响有所不同：20 nm的金纳米粒子作用后的碱性磷酸酶表达量高于40 nm的金纳米粒子。研究表明，纳米颗粒的尺寸、表面的化学修饰等对骨细胞有一定的影响，如金、银、铝和钛纳米粒径的大小对于细胞的状态有影响11。国内研究小组王江雪等从生理毒性方面对纳米TiO2材料进行了研究：纳米TiO2材料自身特有的性质比如：“小”“与生物体亲和性良好”等使得它们容易进入生物体并且与生物体的组织(器官)、细胞、细胞器、蛋白质和生物大分子等相互作用，从而造成细胞和组织的功能异常，进而影响生物体健康12。以往TiO2一直被认为是低毒粉尘，在许多粉尘的毒理学研究中，常用TiO2作无毒的对照。但是，Ferin 的研究发现20 nm 的TiO2纳米颗粒引起的大鼠肺部炎症比同浓度微米级的TiO2更为严重。同组者Oberdorster等13用粒径为20 nm和200 nm的TiO2颗粒做了大鼠亚慢性吸入实验，发现两组大鼠都出现了下呼吸道TiO2颗粒沉积13。国外的Cunha 等14研究表明陶瓷骨支架材料制成的-磷酸三钙（-TCP）和二氧化钛（TiO2）构建的支架-TCP/TiO2支架呈现高增殖率，高生存力，高殖利率。此外，他们还发现了成骨标志物碱性磷酸酶（ALP）活性的增加。这些结果表明，-TCP/TiO2支架具有作为成骨活性的承重支架的良好潜力，以及-TCP的可再吸收性的属性，这些支架可以增强体内骨整合和促进形成新的骨组织，从而可以成为一种非常有前途的对长骨再生的仿生支架材料。国外学者Wang LN15发现：形成二氧化钛预合成羟基磷灰石的纳米管阵列，是用以提高钛植入物的生物相容性的一种很有前途的方法。为了进一步提高医用钛植入物的生物相容性，他们使预先合成的羟基磷灰石和内侧上的纳米管阵列沉积，并研究了阳极氧化的TiO2纳米管阵列的生物相容性，且通过体外评估在模拟体液中预先合成的羟基磷灰石的生物相容性。结果表明，羟基磷灰石涂层上的细胞能够被TiO2纳米管阵列诱导，在5天内先合成的羟基磷灰石。细胞培养物的评价进一步证明细胞附着和增殖对TiO2纳米管阵列，而不是那些没有预先合成羟基磷灰石合成羟基磷灰石的能力有所提高。但是，直接研究纳米TiO2对成骨细胞矿化机制影响的研究却不多。2 实验材料和方法2.1 MEM培养基和相关试剂的配置2.1.1 MEM 培养基配置准确称取NaHCO3 2.2g、Hepes 2g，青霉素0.066g，链霉素0.154g 以及一袋MEM培养基（Gibco）干粉加入烧杯中，加入1000mL 去离子水，磁力搅拌至完全溶解。使用0.22 m滤膜过滤培养基，过滤后的培养基装入试剂瓶，封口后放入冰箱4储存备用。2.1.2 含血清的MEM 培养基配置加入体积分数10%的胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)到MEM 培养基中混匀。2.1.3 分化培养基配置在98.9ml含血清的MEM培养基（MEM+10%FBS）中加入1ml 1mol/L的的甘油磷酸钠(Sigma-Fluka )和0.1ml Vc（抗坏血酸），并将整个体系充分混匀。2.1.4 PBS 缓冲液准确称取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g 加入900mL去离子水，磁力搅拌至完全溶解，定容至1000mL调pH 至7.27.4，即为0.1M的PBS缓冲液。将配置好的PBS 倒入试剂瓶中，126高压灭菌20min，取出放入无菌操作台冷却至室温，以封口膜封好瓶盖后放入冰箱4储存备用。2.1.5 含EDTA的0.25% 胰酶的配制配方：100ml PBS，0.25g胰酶，EDTA称胰酶0.25g，EDTA0.02g；然后将称量物加入配置好的100ml PBS中，在冰浴中低速搅拌小于4小时。调节溶液的pH=7.4。最后0.22m滤膜过滤，分装，可在-20长期保存，或4短期内用完。2.1.6 4%多聚甲醛的配置1） 称取20.0g多聚甲醛粉末。2） 将称好的粉末倒入400ml PBS中，50水浴加热搅拌直至粉末溶解，溶液颜色清亮为止。3） 调节pH 为7.27.4。4） 加入PBS将溶液定容至500ml。2.2 细胞复苏1) 37C水浴预热培养基（MEM+10% FBS）；2) 从液氮中取出细胞迅速放入37C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3) 在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，800-1000rpm离心5min；4) 弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；5) 置于37C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧)；6）第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养2.3 细胞传代1) 37C水浴预热培养基（MEM+10% FBS）；2) 在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；3) 显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（MEM+10% FBS）终止消化；4) 用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；5) 将细胞移入离心管中，800rpm离心5min；6) 弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1104 个/cm2 (2.5105 个/T-25瓶）左右，混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；7) 将培养瓶置于37C，5% CO2的无菌培养箱中培养。依细胞生长状态作为是否需要进行换液的标准。本实验平均每3天换液一次。2.4 纳米TiO2悬液制备1) 准确称取4 种TiO2纳米颗粒10mg 加入50mL 离心管中，高压灭菌。2) 50mL 离心管中加入1600mg 牛血清白蛋白(BSA)，加入40mLPBS 缓冲液，涡旋溶解。3）将涡旋后的缓冲液用0.22m的滤器过滤。3) 向含材料的离心管中加入10mL 含BSA 的缓冲液，涡旋后，超声30min 以使材料充分分散，得到纳米TiO2悬液。2.5 细胞接种1）将培养瓶中的旧培养基用移液枪吸出，在培养瓶中加入适量胰酶进行消化，大约半分钟后把培养瓶放置在普通光学显微镜下观察，发现细胞基本变圆而不再贴壁时，加入适量含血清的培养基将消化终止；若消化过慢则可以将培养瓶放入37培养箱中适当孵育几分钟。2）用移液枪将消化好的细胞吸出放在15ml离心管中，800-1000转/分钟离心5分钟。把离心后的上清倒掉，往离心管中加入新鲜培养基，用移液枪吹吸几次，保证底部细胞已经在新培养基中充分分散。3）根据估算的细胞量将离心管中的细胞适当稀释10-50倍，用细胞计数板在普通光学显微镜下观察并计算出离心管中细胞的总数。4）24孔板上接种的细胞密度为：3104细胞/孔，6孔板上接种的细胞密度为：2105细胞/孔。在细胞贴壁并长满孔板底部的时候，才可进行下一步实验。2.6 纳米TiO2材料悬液的制备小心称取4种不同的纳米TiO2材料：1号材料 10.1mg；2号材料 10.3mg；4号材料 10.4mg；6号材料10.0mg 。将材料装入50ml离心管中，126高压灭菌30min后放入50烘箱干燥。在离心管加入少量牛血清白蛋白（BSA）并用PBS配置成1mg/ml的悬浊液，BSA与纳米TiO2的比例为40:1。2.7 纳米TiO2材料与细胞共培养将纳米TiO2材料悬浊液用分化培养基稀释50倍，待24孔板或6孔板中细胞长满整个底部时，用移液枪吸出其中的培养基，加入用分化培养基稀释的纳米TiO2材料悬浊液。之后，每隔3天为细胞换一次分化培养基。从共培养开始起算第1天，每天观察细胞状态并记录下来，直到第7天。2.8 碱性磷酸酶染色2.8.1 实验原理本实验采用常用的BCIP/NBT法进行碱性磷酸酶染色。BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。通过这个性质可以对细胞是否分泌了碱性磷酸酶做一个初步的定性判断。2.8.2 实验步骤1）本产品试剂盒是从北京碧云天生物技术有限公司购买，按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液： 碱性磷酸酯酶显色缓冲液 10ml BCIP溶液(300X) 33l NBT溶液(150X) 66lBCIP/NBT染色工作液 10.1ml 2) 在24孔板中将细胞与纳米TiO2材料培养7天 将需要进行碱性磷酸酶鉴定的孔标记出来，用PBS洗涤后，加入4%多聚甲醛溶液固定，然后把孔板放入4冰箱保存。待细胞充分固定后取出孔板，用移液枪吸出固定液，加入PBS洗涤3次。3)最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。4)室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 5)去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。6)将染色后的孔板放在显微镜下观察，并拍照。初步评判分泌碱性磷酸酶细胞的个数以及整个孔板中碱性磷酸酶的分泌量。2.9 茜素红染色法对成骨细胞矿化结节进行染色2.9.1 实验原理细胞茜素红（Alizarin red S）钙染色试剂是一种旨在通过鳌和技术，使钙离子和茜素红S 产生复合物，来分析固定处理的细胞样本中橘红色钙沉积现象的权威而经典的技术方法。茜素红是一种蒽醌（Anthraquinone）衍生物：9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐，又称媒介红 3（Mordant Red 3;）或茜素磺酸钠（Sodium alizarinesulfonate）。其分子式为C14H7NaO7S，分子量为342.25。茜素红和钙离子以鳌和方式形成复合物，用以识别组织细胞的钙盐成分。钙盐变化是骨细胞增殖分化和骨组织成骨潜能的标志之一。通过茜红素染色，产生桔红色沉淀，但会受到其它金属元素的干扰，比如Mg2+就是一种常见的干扰。有两种常见的茜素红染液的配置方法：1）1% 茜素红染液：1g茜素红粉末加入0.1M的Tris-HCL 100ml中配制-pH 8.32) 40mM茜素红染液，茜素红粉末用去离子水配制后用氢氧化铵调制-pH 4.1-4.3这两种试剂的区别就是一个是酸性的，一个是碱性的，通常对于细胞内的钙质沉积的染色比如血管钙化、骨骼肌的钙化、其他异位钙化的染色以及培养的细胞钙质沉积的鉴定，通常用碱性的染色液，原因是此种情况的细胞内钙质沉积通常来说量比较少，酸性的染色液会使钙质溶解，导致染色效果差甚至假阴性，所以一般采用碱性的染色液，此外，碱性的染色液通常可以增加染色时间，长的甚至可以达1h以上，以此来获得比较满意的染色效果，这个在酸性染色液是不太可能的。对于酸性的染色液，通常是用于骨、软骨等细胞外基质钙质沉积的染色，通常可以快速的染色，并且具有较好的染色效果。本实验采用第一种染液，1%茜素红染液，pH 8.3。2.9.2 实验步骤在6孔板中将细胞与纳米TiO2材料共培养 21天 将待染细胞的孔板用PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛溶液固定细胞，固定后的细胞放入4的冰箱中。固定完毕后取出孔板，用PBS冲洗两遍，加入茜素红染液，37孵育30分钟后，再用PBS冲洗两遍，将孔板放至显微镜下观察。3 结果与讨论3.1 实验结果3.1.1 细胞与材料共培养的情况在细胞与材料共培养的过程中，我根据文献中提到的“三天更换一次分化培养基”每隔三天给细胞换液。但是，前期的两批实验中，细胞都在第6、7天死亡了。细胞死亡现象比较像缺乏营养死亡的，情状为：1.培养基颜色变黄，比较像营养耗尽的培养基。2.细胞主要从边缘开始成片的脱落；少数孔中也有中间细胞成片脱落的。3.细胞体积变小，由以前的梭形变得更扁，像“针形”。4.仅存的未脱落的细胞已经严重衰老，即使重新加入新鲜培养基也无法增殖，而是逐渐死亡。第三批实验还是选用“三天更换一次分化培养基”的方法，这次1、2、6号材料与细胞共培养的孔板中的细胞全部死亡，但是4号材料与细胞共培养的孔板中还存活了大部分细胞，于是选择暂时用这一批孔板的4号材料与细胞共培养的孔来进行碱性磷酸酶染色，以得到一个初期的结果。3.1.2 碱性磷酸酶染色情况4号材料（实验组） 未加材料（对照组）放大40倍放大100倍放大200倍图中蓝色部分为碱性磷酸酶经过染色后的颜色，可以从图中看出蓝色部分基本为细胞轮廓，说明这些细胞分泌了碱性磷酸酶，细胞已经开始向成骨细胞方向分化。图中透明有轮廓的部分为未分泌碱性磷酸酶的MC3T3-E1细胞。还有个别淡蓝色的细胞，可能是分泌碱性磷酸酶的量太少或细胞破损使碱性磷酸酶流出等原因，染色不明显。3.1.3 茜素红染色情况4号材料（实验组） 未加材料（对照组） 放大40倍放大200倍图中红色部分为茜素红染色后的矿化结节，对比放大40倍的实验组和对照组发现：实验组中染成红色的结节要略多于对照组。图中还有一些不平整的小突起，但却没有明显的被染色的状况，有可能是除了Ca2+以外的其它阳离子干扰，因为茜素红可以和Ca2+螯合成红色物质并沉积，也可以和其它阳离子结合，比如Mg2+，但是在成骨细胞的分化过程中，Ca2+应该是在阳离子中占绝大多数的，所以与Ca2+染色后的颜色相比，其它离子的染色颜色会较为不明显。实验还对同一批次，4个6孔板中的添加4号材料组和未添加材料组的矿化结节进行了计数分析：细胞个数/个平均/个未添加材料（对照组）551467.54号材料（实验组）918121012.25实验发现 ：实验组的平均矿化结节个数要多于对照组，但是由于同组实验的数据差距比较大，而且每组实验一共只有4个数据，所以数据的可信性不高。3.2 实验讨论3.2.1 情况一：从分子水平看，细胞分化意味着各种细胞内合成了不同的具有专属性的蛋白质，同时可能还需要分解掉以前的蛋白质，这是需要消耗能量的。而且已知的大部分细胞分化都是消耗能量的。所以我猜想，MC3T3-E1细胞系在向成骨细胞分化的过程中，是需要从周围环境汲取能量的。1、2、6号纳米TiO2材料对MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化有促进作用，所以在存在这些材料的孔板中，细胞分化加速，并且使得整个孔中的细胞提早进入分裂增殖期，导致能量消耗过快，而周围培养基的养分不足以支持细胞等到三天后的下一次换液，所以细胞大部分都由于营养不良而死亡。而4号纳米TiO2材料对MC3T3-E1细胞系向成骨细胞分化有抑制作用，但对细胞的健康并没有多大害处，不太会抑制细胞的正常生长与代谢，所以其中的养分消耗慢，可以支持细胞等到三天后的换液时间，大部分细胞生长状况良好。这个猜想也基本符合上述的时间结果，但是暂时还没有证明，在接下来仅剩的两个星期内，我将再进行几批细胞与材料共培养的实验，并设计营养量梯度，以此来判定是否猜想正确（如果营养足够充分，那么1、2、6号材料与细胞共培养后细胞能存活下来，孔板中能分泌碱性磷酸酶的细胞会比不加材料的孔板中分泌碱性磷酸酶的细胞数量多，染色后显微镜下能观察到更多蓝色细胞）。3.2.2 情况二：由于细胞在培养过程中难免有染菌现象，虽然在培养时已经加入了环丙沙星来抑制细菌生长（已知：低浓度的环丙沙星对细胞的毒性很小，但仍然对细菌有抑制效果），但是却不能完全杀死细菌。所以，在孔板中有可能有少数细菌存在并消耗周围培养基的养分，对细胞形成了竞争性抑制，导致细胞由于营养不良而死亡。3.2.3 综合讨论：综上所述：首先，细胞在与纳米TiO2材料共培养后死亡，极大可能是因为缺乏营养导致的，而根本原因可能有两点。第一，细胞与材料共培养过程中出现染菌，细菌的生长消耗了养分从而使得细胞生长缺乏营养。我认为这种可能性是比较小的，因为要让前期三批细胞全部染菌的概率应该是很小的。其次，第三批细胞染菌后4号材料所在的孔板中细胞生长状况良好，那么说明这种材料有抗菌的能力。而同时满足这两点的可能性太小了。所以细胞不太可能是应为染菌而死亡，但这种情况暂时也不能完全否定；第二，1、2、6号材料是可以促进MC3T3-E1细胞系向成骨细胞方向分化的，而4号材料是抑制其向成骨细胞方向分化的。根据之前的文献调研我发现：纳米TiO2材料有时对成骨细胞的矿化是有促进作用的，但有时却是有抑制作用的，但是对纳米TiO2材料能促进MC3T3细胞系向成骨细胞方向分化的报道要远多于纳米TiO2材料抑制MC3T3细胞系向成骨细胞方向分化的报道。所以我在对实验进行预期结果设想时，定的是“纳米TiO2材料能促进成骨细胞的矿化成熟”，现在这种猜想和预期实验结果相似，我认为此猜想正确的可能性比较大。当然，这两种猜想也有可能都不对，那么究竟为什么会出现这样的实验结果，就更值得我们探究了。我将在接下来的时间中尽量探明这个问题。（目前我的实验还没有全部做完，以上只是我的部分结果。）4 实验结论碱性磷酸酶染色试验中，通过图片可以很明显的看到，未加材料共培养的细胞（对照组）比与4号材料共培养的细胞（实验组）分泌碱性磷酸酶的细胞数量明显要多，且分泌碱性磷酸酶的量也要多。这说明对照组有更多的细胞向成骨细胞方向分化，施加了4号材料刺激的细胞只有较为少数的细胞向成骨细胞方向分化。而茜素红染色试验中，从图片上看到细胞与4号材料共培养的组（实验组）和细胞未与材料共培养的组（对照组）的矿化结节数量差不多，而且图片中可以观察到存在Ca2+以外的其它离子的干扰；对矿化结节的计数分析由于数据差距较大且整体数据量较小，所以可信度不高。根据上述结果与分析我得出结论：1）4号纳米TiO2材料抑制了MC3T3-E1细胞系向成骨细胞方向分化的能力。2）4号纳米TiO2材料有利于成骨细胞的钙结节的形成。3）4号纳米TiO2材料对成骨细胞的整个矿化成熟过程来说，起抑制作用。5 致谢在本次实验的过程中，我的指导老师王江雪给我提供了很大的帮助，不仅是从学术指导上，而且在实验的操作以及实验的前期准备过程中，都悉心教导，传授经验；并且这个课题的来源也是王老师辛苦调研文献所得，在此我要向她表达衷心的感谢。还有北京航空航天大学生物与医学工程学院给我提供的帮助，实验的场地、仪器以及一切经费均由此单位承担，没有学校的支持我完成不了实验，在此也要送上我衷心的感谢。6 参考文献1 Akatsu T, Yamada Y, Hoshikawa Y, et al.Multifunctional porous titanium oxide coating with apatite forming ability and photocatalytic activity on a titanium substrate formed by plasma electrolytic oxidation.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2013 1;33(8):4871-4875.2 Victoria Frjd, Paula Linderbck, Ann Wennerberg,et al.Effect of nanoporous TiO2 coating and anodized Ca2+ modification of titanium surfaces on early microbial biofilm formation.BMC Oral Health 2011, 11:8.3 Yao,C Perla V ,McKenzie J L, et al.Anodized Ti and Ti6Al4V possessing nanometer surface features enhances osteoblast adhesion. 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