《蛋白质含量测定法》PPT课件.ppt

蛋白质含量测定法,考马斯亮兰法（Bradford法）,实验原理 考马斯亮蓝G-250染料+碱性芳香族氨基酸 在磷酸的作用下，最大吸收为595nm(兰色）,器材与试剂,722型和753型可见光分光光度计 漩涡混合器 试管16支 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。 考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。,实验方法,标准方法 取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 加完染料20min后，使用722分光光度计（灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。 用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。,微量法 取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。,SDS干扰实验 取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 加完染料20min后，使用753分光光度计（狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。,实验数据与结果分析,标准方法的数据和图,表1 考马斯亮兰标准法实验表格,根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（g）为横坐标，作图1。,图1 考马斯亮兰标准法,图1 考马斯亮兰标准法,微量法的数据和图,表2 考马斯亮兰微量法实验表格 管号12345678910标准蛋白质（0.103mg/ml）00.10.20.40.60.81.0未知蛋白质（约0.5mg/ml）0.40.81.0蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.60.20考马斯亮兰G-250试剂3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A59500.0880.1840.2920.4110.5420.6310.1710.2890.362 根据表2，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（g）为横坐标，作图2。,图2 考马斯亮兰微量法,SDS干扰数据和图,表3 考马斯亮兰SDS干扰实验表格 管号123456标准蛋白质（1.03mg/ml）0.10.10.10.10.10.1SDS (1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸馏水0.90.80.70.50.30.1考马斯亮兰G-250试剂3.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A5950.4230.3360.2750.2000.2130.198 根据表3，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图3。,图3 考马斯亮兰SDS干扰实验,由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮兰法测蛋白质含量有干扰，同是0.103mg/ml的标准蛋白与3.0ml考马斯亮兰，但随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。,紫外吸收法,实验原理 280nm的光吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处有最大吸收。 215nm与225nm的吸收差法：蛋白质因为含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 肽键测定法：蛋白质溶液在238处的光吸收强弱，与肽键的多少成正比。可以测238nm处吸收值，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。,器材与试剂,（一） 器材 1SPECORD200分光光度计 2漩涡混合器 3试管12支 （二） 试剂 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml。,实验数据与结果分析,（一）紫外280nm吸收法数据和图 表4 紫外280nm光吸收法 管号123456BSA (1.03mg/ml)体积01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00BSA浓度（mg/ml）00.2060.4120.6180.8241.03A28000.1580.2700.3790.5140.645,根据表4，以A280为纵坐标，SBA浓度为横坐标，作图4。,图4 紫外280nm光吸收法,根据直线拟和方程y=0.6105x+0.0132求解当标准蛋白（牛血清清蛋白） 与文献值6.3比较接近。,紫外215nm与225nm的吸收差法的数据和图表5 紫外215nm与225nm的吸收差法 管号123456未知BSA (1.03mg/ml)体积00.10.20.30.40.5H2O5.04.94.84.74.64.5BSA浓度(g/ml)020.641.261.882.4103A21500.2870.4590.7941.0901.4010.574A22500.1650.2640.4390.6210.8030.286吸收差00.1220.1950.3550.4690.5980.288 根据表5，以吸收差为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，作图5。,图5 215nm与225nm吸收差法,肽键测定法,表6 肽键吸收法 管号123456未知BSA (1.03mg/ml)体积00.51.01.52.02.5H2O5.