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文档简介
实验八 酮体的生成和利用,一、实验要求: 1、加深理解何谓酮体,是怎样生成和利用的。 2、掌握酮体定量测定的方法。 3、了解活组织培养是研究中间代谢的基本方法。 4、掌握分光光度计的正确使用。,二、原理: 酮体是脂肪酸氧化的正常中间产物,包括乙酰乙酸,羟丁酸和丙酮三种物质。主要在肝脏中生成,而在肝外组织氧化。,本实验以丁酸钠为底物,与肝组织或肌肉组织糜一起或分别保温培育,测定培育液中酮体的含量。两种情况下的酮体含量的差别,可帮助我们理解上述理论。,酮体定量: (丙酮) 1、丙酮 + 2,4二硝基苯肼 丙酮 2,4二硝基苯腙 2、在酸性条件下用CCl4将丙酮 2,4二硝基苯腙分离 提取而与其它苯腙衍生物分开。,3、苯腙在碱性条件下,呈现红棕色,颜色的深浅与丙酮的含量在一定范围内呈直线关系,故可用比色分析法测定丙酮的含量。该法也可用于临床血和尿中酮体的定量测定。,三、试剂: 1、15 三氯乙酸(酶蛋白变性,终止反应) 2、丙酮标准液:0.079 mg/ml,四、主要器材: 1、剪刀、镊子一套,50 mL 锥形瓶4个,10 mL 具塞试管6支,离心管4 支 2、恒温振荡器、离心机、分光光度计 3、兔子 (室温1020饥饿 48 小时),恒温振荡器,五、操作步骤(6人一组) 1、肝组织糜与肌组织糜的制备(糜倒入塑料筐) 取肝脏5g,置于表面皿上,用剪刀剪细剪匀,为肝组织糜,平均分成4份(每份约1g)。不要捻碎! 取肌肉约5g,按上述方法制成肌肉组织糜,平均分 成2份(每份约2g) 。,2、取50mL锥形瓶4只,编号,按下表添加剂: 混匀,置于37恒温振荡器中振荡2小时。,摇匀后在测定瓶2和4中加入15三氯乙酸2.5mL,3、振荡后,取出锥形瓶,摇匀后在测定瓶1和3中分别加入15三氯乙酸2.5mL,混匀,静置10分钟,然后各瓶分别倒入4支离心管中,2000rpm 离心10分钟(弃去残渣,注意离心管平衡)。,4、取10mL具塞试管6支,其中4只分别加入上述滤液 3.0mL,1支作为标准管,内加丙酮标准液3.0mL,1支作为空白管,内加试剂混合液3.0mL。然后各管分别加入酸性2,4二硝基苯肼2.0mL,CCl4 3.0mL,塞紧。,1、剧烈振荡7分钟(注意放气体),静置,用滴管吸去上层酸液(先吸除泡沫)。 2、用5mL蒸馏水洗1次,振荡3分钟,除去上层水液(除去苯肼)。 3、各管中再分别加入0.5mol/LNaOH溶液4.0mL,将塞塞紧剧烈振荡3分钟。,5、取上层碱液,波长520nm,进行比色测定。 (若混浊,3000rpm 离心5分钟) 6、结果( A1A2 ,A2 A4),6、计算 1g肝组织2小时生成酮体的 mg 数(以丙酮计) = (A1-A2)/A标 0.079 3 12/3 = (A1-A2)/A标 0.948,2g肌肉2小时利用酮体的 mg 数(以丙酮计),六、注意事项: 1、在分离提取过程中,若泡沫过多可用离心法除去。 2、比色液若有混
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