实验动物的选择和利用.ppt

第九章 实验动物的选择和利用,第一节 实验动物选择基本原则,一、根据课题研究的目的、内容、水平，选用相匹配的标准化动物 一切动物实验都是为科学研究服务的，选择实验动物，首要的就是要根据研究的内容来选择实验动物。,蛙的大脑不发达，不可作为高级神经活动的实验，但蛙的脊髓具有最简单的发射中枢，做神经反射弧实验，简单、直观、明确、容易分析。,二、必要的预试验有助于选择与本课题相适应的实验动物 动物预试验的作用在于 1.初步观察动物是否适宜于本项目的研究 2.熟悉动物的生物学特性及饲养管理 3.检查与动物实验配套的实验条件、方法是否初步到位,三、充分利用与人具有某种相似性的实验动物 绝大多数生物学与医学研究的最终目的是要为人类服务的。因此在实际可能的情况下，尽量选择那些生物学特征及解剖生理特点等与人类类似的实验动物。,一般来说，实验动物愈高等，进化程度愈高、其机能、代谢、结构愈复杂反应就愈接近人类，猴、拂拂、猩猩、长臂猿等灵长目动物是最近似于人类的理想动物。但实验动物中，并非仅灵长类动物在生物学特性、解剖生理特点等方面与人具有相似性。,1.结构功能的相似性,2.时象或年龄状态的相似性,3.群体分布的相似性 在以群体为对象的研究课题,有时要考虑到选择与人群基因型及表现型分布类型相似的动物类别。主要是一些封闭群动物,如:KM小鼠,Wistar大鼠,毕格犬等。,人类,封闭群动物,群体分布相似,4.生态或健康状况的相似性 在正常生命过程的研究中，找到与人类生态情况相似的替代模型非常重要。现有的不同微生物学质量级别的普通动物、清洁动物、SPF动物、无菌及悉生动物分别代表着不同的微生态模式并具有不同特点,适用于不同研究目的。,5.疾病特点的相似性 实验动物有许多自发或诱发性疾病能局部或全部地反映与人类类似的疾病过程及特点，可用于研究相关的人类疾病。,6.操作实感的相似性 外科手术性的操作模型中或教学示教中,常选择体型较大的动物。,1.差异性原则 由于物种之差异，各种动物之间存在基因型、组织型、代谢型、易感性等方面的差别，这种差异有时可作为研究课题所需的一种指标或特殊条件。,四、除利用与人具有的相似性以外的实验动物选择原则,如：对毒性或抑制机制的敏感性的差异常被利用于药物尤其是抗菌、抗肿瘤药物的研究，这类差异越大则药物特异性越强。利用这一特点，人们可能找对人类毒性小而对病原微生物或肿瘤细胞杀伤力强的药物。 又如，免疫缺陷模型在组织排斥反应上的差异，使得同种异体移植或异种异体移植得以实现。,2. 易化原则 进化程度高或结构机能复杂的动物有时会给实验条件的控制和实验结果的获得带来难以预料的困难。应依据易化原则选择那些结构功能简单而又反映研究指标特质的动物。,例如：在遗传研究中，用寿命短、繁殖快的果蝇取得了丰硕的成果，而同样方法若改用 灵长目动物其难度是很难设想的。 有时为了删除系统作用背景对某器官或某功能进行研究，可用离体方法进行。,3.相容或匹配原则 所谓“相容”或“匹配”是指所用动物的标准化品质应与实验设计、技术条件、实验方法等条件相适应。在设计实验时不但要了解实验仪器精度和灵敏性能了解试剂的品质、性能以及试剂和仪器之间的匹配性能，也要了解动物或动物模型对实验手段的反应能力。 避免应用高精仪器、试剂和低品位动物或低反应性能匹配，或用低性能测试手段与高反应性动物相匹配的不相协调的配合。,4.易获性原则 易获性是理想的实验动物条件之一。 虽然猫、狗、猪及灵长动物居于较高进化水平各有其研究价值，尤其是灵长类动物在许多方面有不可替代的优越性。然而这些大动物则往往由于其较长生殖周期，低繁殖率或产仔率等弱点而影响其易获性，因而亦影响其被选用，故通常不作首选。,从Little 1901年育成第一株近交小鼠至今，已有常用近交系小鼠260多系，近交大鼠100多系，30多系近交地鼠，还有近交系鼠和近交免。此外，还有许多啮齿目封闭群、突变系、杂交系动物可供选择。 这些动物因其繁殖周期短，多胎性等特点，使其非常易获，且又是小型哺乳动物，在进化上比其他纲的脊椎动物要优越，而且有丰富而清楚的背景资料、文献索引、价低、分布又广，故为实验的良好选择。, ,5.重现性、均一性原则 重现性和均一性为实验结果质量品质所在。若实验结果不能再现或不稳定，则该结果的可靠性便成了问题。,理论上说一定的基因型产生一定的表现型和演出型。因此，选择基因型一致或相似是保障重现性和稳定性的重要措施。一般情况下近交系动物的生物反应稳定性、实验重复性都较封闭群好。F1代杂交群在一定程度上兼有近交系和远交群的特点。 封闭群动物虽然能较好地代表自然群体但群与群之间有时存在有差异。因而在重现性上都有一定问题。,周围环境与发育环境是影响实验动物表现型、演出型的重要因素。营养因素对胚胎影响、不同微生态环境、动物的疾病状况等等，都会影响实验反应稳定性，故也是选择实验动物的重要指标。 genotype基因型 发育环境 developmental phenotype表现型 周围环境 proximate dramatype 演出型,五、动物实验结果的外推,大多数生物学与医学研究的最终目的是要为人类服务的。因此动物模型和动物实验结果都要外推到人身上去，这就是动物实验结果的外推（extrapolation）。 因为动物与人不是同一种生物，加之不同的动物有不同的功能和代谢特点，所以肯定一个实验结果最好采用两种以上的动物进行观察比较。,所选的实验动物中一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物。 常用的实验序列是小鼠、大鼠、狗、猴或小型猪。,六、选用与实验要求相适应的实验动物规格,1.年龄 实验动物的年龄不同，其生物学特性也不同。 2.体重 实验动物的体重与年龄有一定的相关性，在正常营养状态及饲养条件下，也可根据体重加以选择，发育正常、体重符合要求的实验动物。,3.性别 许多实验证明，同一品种（系）动物不同性别对许多外界刺激的反应不一致，对实验结果的影响不同。 一般来说，无特殊要求宜选用雌雄各半。 ,七、实验动物的选择和应用要注意有关国际规范和动物福利,国际上普遍要求动物实验达到实验室操作规范（Good laboratory pracitice，GLP）和标准操作程序（Standard operating procedure，SOP）。 同时国际上广泛宣传3R原则。,第二节 论文中动物实验的描述,品种、品系的名称 微生物质量 来源 合格证号 性别,年龄 体重 数量 实验和饲养环境 动物实验处理方式,第三节 医药研究中实验动物的选择和应用,药理学研究中的选择 主要药效学 一般药理学 药物代谢动力学,一、主要药效学 新药药效学研究技术指导原则 （一）总的要求： 1.方法 体内体外两种以上试验方法证明主要药效，其中一种必须是整体的正常动物或模型动物。 实验模型必须能反映药理作用的本质。确无法满足上述动物和模型要求时，应予以充分说明理由，改用其它模型。,2.指标 应能反映主要药效作用的药理本质客观，能定量或半定量。 3.剂量 应做出量效关系，尽量求出ED50，或有效剂量范围。量效关系不明确的药物应说明原因。,4.给药方法 应采用拟推荐临床应用的给药方法。如该法在动物上无法实施时，应予说明，改用他法。 5.对照 应有空白对照和巳知标准阳性药物或治疗措施对照。,（二）有关说明： 1.动物选择 一般选择的动物应是品系清楚、成年、健康、雌雄各半、符合实验动物管理要求、且对药效学反映敏感的动物。 但同时要注意对动物年龄、性别、种属的选择。 2.模型的建立,3.分组： 单组比较设计：同一个体的前后观测指标比较，消除了个体差异 配对比较设计：将性质相同的动物为一对，配成若干对，再将一对动物随机分配在两组，取得均衡实验。减少误差和个体差异 完全随机设计 拉丁方设计：适用于多因素实验 正交设计：多因素、多水平的实验。,4.剂量,(一)最小有效量 药物达到开始出现药效的剂量。 (二)极量 是指安全用药的极限剂量。 (三)治疗量(常用量:)治疗量是指临床常用有效剂量范围。它比最小有效量要高，又比药物极限量要低。 (四)最小中毒量 最小中毒量是指药物已超过极量，使机体开始出现中毒的剂量。,(五)中毒量 中毒量是指大于最小中毒量，使机体中毒的剂量。 (六)致死量 致死量是引起机体死亡的剂量。 (七)药物的安全范围 是指最小有效量与极量之间的范围。安全范围广的药物，其安全性大；安全范围窄的药物，其安全性小。以上是临床应用的各种剂量。此外，在实验研究中，还要引用统计学计算的两种剂量：半数致死量(LD50)及半数有效量(ED50)。,（1）给药量的确定 参考结构和作用相似的药物剂量作为应用剂量 或者以小鼠中毒剂量或致死剂量的1/5或1/10作为应用剂量 按等比关系设立至少3个剂量组进行动物实验 考虑动物种属，年龄，给药途径调整给药剂量。,（2）人与动物及各类动物间药物剂量的换算 按体表面积计算 A=K(W2/3/10000) A：体表面积（m2）；W：体重(g); K：体表面积系数,例如：某药大鼠剂量为250mg/kg，问犬的给药剂量？ （假设一般实验大鼠0.2 kg，实验犬10 kg） 算大鼠体表面积：A=0.031 m2 将mg/kg 剂量换算为mg/ m2剂量： （250mg/kg 0.2 kg）/ 0.031 m2=1608 mg/ m2 算犬体表面积： A=0.5198m2 算犬给药剂量： 1608 mg/ m2 0.5198m2 /10 kg =84 mg/kg,按体型系数换算 dA=dBRA/RB（wA/wB）1/3 dA和dB分别是A、B两种动物的每kg体重剂量（mg/kg) RA和RB分别是A、B两种动物的体型系数 wA和wB分别是A、B两种动物的体重,二、药物代谢动力学 目的：了解新药在动物体内动态变化的规律及特点，为临床合理用药提供参考。 内容：药时曲线、吸收速率、清除速率、分布情况等等。 健康成年动物 首选动物种类及性别尽量和药效学或毒理学一致。 药物动力参数测定以大动物为好。 药物分布实验以大鼠或小鼠为好。,三、一般药理学研究 目的：了解新药的全面药理作用， 补充毒性观察之不足，为长期毒性的试验设计提供参考。 内容： 至少观察3个系统，神经系统 、心血管系统、 呼吸系统 。 尽量选择和主要药效学一致的动物 对心血管系统和呼吸系统，一般用犬，而不用小鼠和兔 对性别要求不严。 对神经系统，多用小鼠、大鼠,（一）抗肿瘤药物研究 抗肿瘤药物的研究中常选择以下3种类型的动物模型。 1.自发性肿瘤模型 2.诱发性肿瘤模型 3.移植性肿瘤模型,四、一些常用药物研究中的动物选择,自发性肿瘤模型 如：AKR的自发性白血病，C3H的自发性乳腺癌 诱发性肿瘤模型 用射线、二甲基苯蒽（DMBA）、黄曲霉素等诱发大小鼠、兔等发生癌症。 移植性肿瘤模型 通常是接种一定数量的肿瘤细胞，或者是一些可致癌的病毒滤液，成功率接近100，是最常用的抗肿瘤药筛选模型。,早期的抗癌药物研究均已动物肿瘤为筛选模型，随着T细胞免疫缺陷的裸鼠以及T、B细胞均缺陷的Scid鼠的发现，人体肿瘤异种移植动物模型得到了极大的发展，为抗癌药物的寻找提供了更好的动物模型。,（二）心血管系统疾病研究 1、动脉粥样硬化症研究： 早期选用鸟类（鸡和鸽）和兔。 但兔病变的局部解剖学与人类不同。兔是草食动物，胆固醇代谢与人不完全一致。 目前常用大鼠、小型猪、狗、鸽、非人灵长类。 恒河猴可以广泛的主动脉和各个动脉的粥样硬化。 猪在高脂饲料诱导下形成的动脉粥样硬化病变和分布与人很相似，又较猴便宜。,2、高血压研究： 常用狗和大鼠 试验性高血压模型常对动物给予加压物质或进行手术结扎肾动脉制备 自发性高血压动物模型有，等大鼠品系,SHR (spontaneously hypertension rat)是日本人okamoto用Wistar交配逐代选育而成。其发病表现与人原发性高血压极为相似，是高血压研究的最佳模型。1.52月龄就开始出现病变。血压高、心脏肥大、出现脑梗死、心肌梗死、动脉肥厚等。繁殖正常。 它和人类自发性高血压有很多相近之。如：都是遗传因素占主要地位；病程相似，血压随年龄增加而增加；高血压早期有高血流特征；刺激和大量摄入食盐加重病情；发生继发性心血管损害,3、心肌缺血试验研究： 狗、猪、兔、大鼠、猫。 狗心脏解剖和人类似，冠状血管容易操作，心脏抗紊乱能力强，狗容易驯服。 猪的冠状循环和血液动力学和人类似，侧枝循环比狗少，容易造成心肌缺血 兔开胸手术不需要人工呼吸,4、心率失常试验研究： 豚鼠、狗、猪、猴、兔、大鼠、猫。 需要注意：小型动物因心脏小，冲动传递通路比较短，心室失常的震颤自发恢复较快。 大鼠对强心甙不敏感。大小鼠心电图无ST段。 若做开胸和心脏实验，兔是首选动物。,（三）消化系统疾病研究: 1、狗有发达的消化系统，而且有与人相似的消化过程，适宜作消化系统的慢性实验。 2、猕猴适合做人痢疾杆菌病， 3、大鼠肝再生能力强，适合肝切除术， 4、维生素C缺乏症选择豚鼠。 5、胃溃疡多选择大小鼠给以寒冷刺激、醋酸烧灼、幽门螺旋杆菌感染等方法,5、乙肝病毒的研究黑猩猩最适合，但不易获得。雏鸭DHBV感染，土拨鼠WHBV感染和人HBV感染有一定差别。树鼩HBV感染表现为一过性，复制和表达水平不高。近年来HBV转基因小鼠受到重视。,（四） 呼吸系统疾病研究: .镇咳药 首选动物是豚鼠豚鼠对化学刺激或机械刺激都很敏感。狗也是咳嗽的良好动物模型狗的咳嗽在反复刺激时变异小，故特别适合观察镇咳作用持续时间一般不用大小鼠，因为它们喷嚏和咳嗽动作很难区别。也不用兔。,2、支气管哮喘 最常用的是大鼠、豚鼠、狗。豚鼠的支气管平滑肌对致痉剂和药物反应敏感 3 、祛痰药研究选用雄性小鼠、兔或猫。 4、大鼠可以用做实验性肺纤维化、矽肺、肺水肿研究 5、豚鼠可用做结核杆菌、白喉杆菌研究,（五） 神经系统疾病研究： 1、镇痛药一般用大鼠或小鼠，但热板法一般不用于雄性动物，因为雄性动物阴囊对热敏感 2、研究神经传导首选猫 3、沙鼠因为Willis动脉环不完整，结扎一侧总动脉，沙鼠出现脑梗塞。沙鼠还可以作为自发性癫痫模型。 4、家兔颈部减压神经、迷走神经、交感神经独立行走，可以用来研究减压神经对心脏的作用,5、DBA/2N小鼠（35日龄）听源性癫痫发生率为100%。 C3H/eN小鼠对脊髓灰质炎病毒Lan-sing 株敏感。C57BL/KalWN小鼠有先天性脑积水。 6、研究吗啡的时候注意，吗啡对小鼠和猫表现为中枢兴奋作用，而对犬、兔、猴、大鼠、人表现为中枢抑制。 7、灵长目用于行为学研究 8、树鼩的神经系统有特色，对它进行脑外科手术，无须麻醉树鼩也可以忍受切割皮肤、肌肉、硬脑膜等引起的疼痛。表现仅为流口水，而不挣扎。,9 、抗焦虑药研究一般选用成年健康小鼠、大鼠、兔等。长期实验应选用雄性动物为好，因为雄性动物耐受性强。抗抑郁药可选用小鼠、大鼠，其次为狗、猪。,（六） 内分泌系统疾病研究： 有多种基因突变动物 1、db：糖尿病基因（diabetes),为4号染色体隐性突变基因。发现于C57BL/KsJ小鼠。纯合子糖尿病伴有肥胖症。多食、多饮、多尿，高血糖，尿糖，胰岛素分泌过多。短寿，纯合子一般不孕。,2、ob：肥胖基因（obese),为6号染色体隐性突变基因。纯合子单纯肥胖，或伴有轻度糖尿病。4周龄就表现肥胖。89月龄可达峰值70g。一度有中高血糖，但随后自行消失。免疫反应水平降低。,3、NOD/LtJ小鼠 NOD小鼠由日本Aburahi的Shionogi研究实验室培育而成。NOD小鼠在糖尿病形成中所产生的胰岛炎(insulitis)症状，是指胰脏小岛中产生白血球的浸润物。约周龄的母鼠有明显的胰岛素含量降低的现象；而雄鼠则于稍后几周也发生此现象。糖尿病开始时有明显的中度糖尿病症，非禁食期的葡萄糖含量高于250mg/dl。主要用于糖尿病和免疫学方面的研究。,4、dw：矮小基因(dwarf) 1929年Snell发现。纯合子脑下垂体前叶缺损，几乎不分泌生长激素，肾上腺素分泌水平很低，睾丸和卵巢发育不正常，雌雄都无繁殖能力。发育到10日龄就明显小于正常小鼠，到20日龄体重不再增加，体重仅为正常小鼠1/3。与之类似还有af(ames dwarf)基因。,5、di：尿崩症基因(diubetes insipidus) 3号染色体隐性基因。纯合子下丘脑病变使加压素和抗利尿激素分泌减少。症状为烦渴、多尿、尿渗透压低。是遗传性下丘脑尿崩症良好模型 6、fa：肥胖基因(fatty) 5号染色体隐性基因。纯合子食欲亢进、胰岛素分泌过多、血浆中脂肪含量是正常的10倍、胆固醇也偏高。3周龄就表现肥胖，40周龄是正常大鼠的2倍。雌雄不育。,做有关代谢试验是，宜选择雄性动物，因便于收集尿液。肾上腺皮质激素类药物研究可选用大鼠、小鼠。H1受体激动药物或阻断药物研究首选是豚鼠，其次为大鼠，雌雄各半。,（七） 计划生育药物研究 注意动物生殖生理特点 繁殖周期：狗春秋二季季节性单发情；猫春秋二季季节性多次发情；大小鼠、豚鼠、家兔常年多次发情；猕猴有月经周期 排卵方式：兔、猫、骆驼诱导排卵；其他自发排卵 发情周期：发情前期、发情期、发情后期、发情间期,终止中期妊娠药物或子宫收缩药物的研究常选用雌性大鼠、豚鼠、家免、猫。 女用避孕药常选用雌性大鼠、仓鼠、家 兔及猕猴，且尽可能选用近交系动物。男用避孕药常选用雄性近交系大鼠或猕猴。,五、药物毒理学及安全性评价试验中实验动物的选择和应用,20世纪60年代的“反应停”事件 反应停（Thalidomide）是西德一家制药公司50年代末期生产的一种镇静催眠药，具有止吐作用。孕妇在怀孕一二个月时，往往会产生强烈的妊娠反应，服用这种药后，能暂时减轻妊娠反应。 1959-1962年，欧洲19国和日本相继出生了12000多名手脚异常的畸形婴儿。这种婴儿手脚比正常人短，形状如海豹甚至根本没有手脚。伦兹博士对这种怪胎进行了调查，于1961年发表了“畸形的原因是催眠剂反应停”的结论，使人们大为震惊，并引起各国政府相关部门的高度重视。,反应停引起的肢体畸形,（一） 急性毒性实验 指动物一次或24小时内多次给予大剂量药物后，观察：LD50、毒性靶器官、中毒表现等。 一般选择小鼠、有时也选择大鼠。一类新药，还要求增加犬或猴实验。 小鼠体重18-22g，同次试验体重相差不超过4g，大鼠体重120-150g，次试验体重不超过20g；狗用成年狗。 雌雄各半。 小动物要求4-6组，每组至少10只；狗6条。,（二） 长期毒性实验 指是反复多次给药于动物，观察药物对动物的毒性反应，一般是指连续给药14天以上，一般在3个月以内，特殊情况可在3个月以上。过去将长期毒性试验分别叫过亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、慢性毒性试验和终生毒性试验。 要求两种动物。一种为啮齿类，首选大鼠。另一种为犬，首选Beagle犬。 雌雄各半 3个剂量组，大鼠每组至少10只，犬每组4只。实验时间越长，需要动物越多。,（三） 特殊毒性实验 包括：致突变实验；致癌实验；生殖毒性实验 生殖毒性实验包括一般生殖毒性实验、 致畸敏感期实验、围产期毒性实验。 不同种属动物要求至少两种动物。 啮齿类可用小鼠、大鼠、仓鼠等，非啮齿类兔、犬、雪豹及灵长类。常用大鼠和兔。,致突变实验一般用NIH小鼠。现在各国致力于替代实验。 致癌实验一般选择小鼠或大鼠，如A系小鼠，F344大鼠。长期致癌试验对实验动物要求很高，必须提供动物饲养场5年内该品系大、小鼠的癌症自发率数据。,对环境要求也很高，动物应饲养在SPF环境中，要排除一切其它致癌因素。 基因