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2003.08 选定乳制品中金黄色葡萄球菌的计数 金黄色葡萄球菌计数 AOAC2003.08 乳制品中金黄色葡萄球菌计数

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内容简介：

AOAC 官方方法官方方法 2003.08 选定乳制品中金黄色葡萄球菌的计数选定乳制品中金黄色葡萄球菌的计数 3MTMPetrifilmTM 金黄色葡萄球菌测试片法金黄色葡萄球菌测试片法 首次发布首次发布 2003 （适用于冰淇淋、原奶、酸奶、奶酪和乳清粉中金黄色 葡萄球菌的计数） 注意：检测材料在使用以后要经过高压灭菌处理。 表格2003.08为验证并采纳该方法的多个实验室的研究 结果。 A. 原理原理 Petrifilm 金黄色葡萄球菌测试片是一种即用型的培 养基系统，含有冷水可溶性凝胶。测试片中的用于显色 的经过改良Barid-Parker培养基对于金黄色葡萄球菌有 选择性作用。 在每个测试片中加入 1.0mL 的经过稀释的 样品用于检测。接种后使凝胶剂固化，并将测试片在 351或者 371下培养 242 小时。 测试片上紫红色 的菌落为金黄色葡萄球菌。当只有紫红色菌落出现时， 计算菌落数，测试结束。 如果检测中出现了背景菌落，要使用 Petrifilm 确认 反应片来识别疑似菌落中的金黄色葡萄球菌。只要有其 它颜色的菌落出现在测试片中，比如黑色菌落或者蓝绿 菌落，就要使用 Petrifilm 确认反应片。Petrifilm 确认反 应片含有指示剂和脱氧核糖核酸。金黄色葡萄球菌生成 脱氧核糖核酸酶（DNase） ，与指示剂反应产生粉红色 区域。将确认反应片插入测试片中，将它们一起在 351或 371下培养 13 个小时。 金黄色葡萄球菌 （少数情况下可能是猪葡萄球菌和中间葡萄球菌，两者 都会产生肠毒素）能产生粉红色晕环。不管晕环面积多 大，将所有的粉色区域计为金黄色葡萄球菌。 B. 设备和试剂设备和试剂 （a） 3M Petrifilm金黄色葡萄球菌测试片3M Microbiology（St. Paul, MN）生产的测试片中含有冷水 可溶性凝胶和用于显色的经过改良的Barid-Parker培养 基。 （b） 3M Petrifilm确认反应片3M Microbiology 生产 的反应片中含有甲苯胺蓝和 DNA。 （c） 塑料压板3M Microbiology 生产的带有把手的 压板，边壁光滑并能用于将样品均液均匀地分布在培养 测试片中的生长区域。 （d）移液管1.0 或 10.0mL 校准用移液管，刻度为 0.1mL。3MTM电子移液器和尖嘴，或者同等性能用于转 移 1.0mL 液体的设备。 （e） 菌落计数器标准设备，优先使用 Quebec 型， 或者是能够提供同等放大倍数和可见度的设备。 （f） NaOH溶液无菌，浓度 1M。将 20g NaOH 置 于 500mL 能承受压热器作用的容器中，用 500mL 水溶 解。在 121下高压灭菌处理 15 分钟。 （g） 磷酸盐缓冲稀释液（1）原液将 34g KH2PO4 溶解于 500mL 水中，用大约 175LNaOH 溶液（1M） 将溶液 pH 值调整至 7.2，并稀释到 1L。储存于冰箱中。 （2）稀释剂用水将 1.25mL 原液稀释至 1L。用此溶 液制备稀释空白液。配制足够多的溶液，以弥补高压灭 菌处理中的溶液损耗。在 121下高压灭菌处理 15 分 钟. （h）搅拌器配有灭菌罐的高速搅拌器（16000 18000 rpm） （i ）培养器温度保持在 351或者 371。 （j） 天平秤重范围 20001g （k） pH 指示剂测量范围在 6.0-8.0 之间。 C. 测试用样品均液的制备。测试用样品均液的制备。 使用秤重为 2kg 敏感度为 0.1g 的天平 B（j） ，在无 菌情况下称取 50g 的测试样品置于搅拌器 B（h）中。 加入 450mL 水稀释 B（g） ，并以 16000 至 18000rpm 的转速搅拌 2 分钟，使其均质。如果全部的测试样品质 量小于 50g， 称取样品并加水， 以 1:10 的比例进行稀释。 按要求用 1M 的 NaOH 溶液将稀释后的溶液的 pH 值调 整到 6.0 至 8.0（样品浓度大约为 0.1mL/g） 。不要使用 柠檬酸盐，酸性亚硫酸盐或者硫代硫酸盐的稀释液，因 为它们会抑制细菌生长。以 90mL 水和前一次溶液中的 10mL 溶液相混合，制取所有的十倍递减稀释溶液。移 液管 B（d） ，必须精确移取所需体积的溶液。不要用移 液管移取小于本身体积10的溶液。 比如， 不要用10mL 以上的移液管移取 1mL 的溶液；不要用 1mL 的移液管 移取 0.1mL 溶液。以每 7 秒 30cm 的速度左右摇晃 25 次，将所有的溶液混合。 D. 分析分析 将 Peterifilm 金黄色葡萄球菌测试片 B（a）置于水平表 面。提起上层膜，将移液管垂直置于培养测试片上方， 将 1mL 测试用样品均液接种于测试片中央。小心将上 层膜覆盖在接种面上。对压板 B（c）的中心轻轻施压， 将测试样品均液均匀地分布于 30cm2的生长区域内。 将 测试片静置，以使凝胶固化。将计数测试片在 351 或者 371下培养 242 小时。 将培养测试片水平朝上 放置于培养器 B（i）中。每叠不要超过 20 片。用菌落 计数器 B（e）对培养测试片进行计数，观察菌落的颜 色。如果在 242 小时之后没有菌落或者只有紫红色的 菌落出现，以紫红色菌落的数量计为金黄色葡萄球菌 数。如果还出现其它颜色的菌落，用 Petrifilm 确认反应 片 B（b）确认。 将 Petrifilm 确认反应片插入培养测试片中。 用戴上 手套的手指轻压整个测试片接种区域（包括边缘） ，以 保证确认反应片和培养测试片中的凝胶的均匀、充分接 触，并除去气泡。然后在 351或 371下培养 1-3 小时。每叠不要超过 20 片。不论菌落是否出现，将粉 红色区域计为金黄色葡萄球菌。粉红色区域通常与金黄 色葡萄球菌有关，但有少数可能是猪葡萄球菌或中间葡 萄球菌。 与粉红色区域无关的菌落不是金黄色葡萄球菌