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2000.15 食物中大肠菌群的快速计数 再水化干膜法

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内容简介：

17.3.04A AOAC 官方方法官方方法 2000.15 食物中大肠菌群的快速计数食物中大肠菌群的快速计数 再水化干膜法再水化干膜法 PetrifilmTM大肠菌群快速测试片法大肠菌群快速测试片法 首次发布首次发布 2000 （适用于食物中 14-24 小时内大肠菌群的计数。 不适用于切碎的棕色土豆） 表2000.15A和B为验证并采纳该方法的多个实验室的研究结果。 A. 原理原理 本方法使用的测试片中的培养基添加了 pH 指示剂，和冷水可溶性凝胶。 在每张测试片上滴加 1mL 未经稀释和经过稀释的样品均液。 将塑料涂压板置于测试片上并施压，使样品均液均匀地分布在约 20cm2的生长区域内。将凝胶固化，对测试片进行培养并计数。可以使用移液管或者自动移液器移取样品均液，用于计数大肠菌群数。 B. 设备和试剂设备和试剂 （a）Petrifilm快速大肠菌群（RCC）测试片。测试片（购自 3M Microbiology Products, St. Paul, MN 55144） ，含有改良的结晶紫中性红胆盐（VRB）培养基、冷水可溶性凝胶、四唑指示剂和 pH 指示剂。 （b）塑料压板与 Petrifilm 测试片一起提供，有一个凹面和一个平面，用于将样品均液均匀地分布在测试片的生长区域。 （c）移液管1.0 或 10.0mL 校准用移液管，刻度为0.1mL。移液管必须精确移取所需体积的溶液。不要用移液管移取小于本身体积 10的溶液。比如，不要用 10mL以上的移液管移取 1mL 的溶液；不要用 1mL 以上的移液管移取 0.1mL 溶液。 （3MTM电子吸移器和吸液头，或者同等性能用于转移 1.0mL 液体的设备。 ） （d）菌落计数器Quebec Dark-field 菌落计数器（VWR Scientific Products，Willard, OH） ，或者同等性能的产品。 （e）无菌氢氧化钠溶液1M.将 40g NaOH 溶于水中，并用水稀释至 1L。在 121下高压蒸汽灭菌处理 15 分钟。 （f）稀释液以如下方法制备原液：将 34g KH2PO4加入 500mL 水中，用 1M 的 NaOH 溶液（大约 175mL）调整 pH 值至 7.2， 并用水稀释至 1L。 将 1.25mL 原液于加入1L 冷却的沸水中稀释至 1L， 以制备缓冲用水。 在 121下高压蒸汽灭菌处理 15 分钟。 （g）搅拌器或者stomacher拍击式均质机韦林氏搅拌器或者同等性能的产品，或者 Seward 公司（98 Great North Rd, London N2 OGN UK, +44（0）20 8365 4100）的 400 stomacher 拍击式均质机, 或者同等性能的产品。 C. 测试用悬着液的制备测试用悬着液的制备 按照 966.23B 的方法（见17.2.01）制备测试用的样品均液。规定的稀释倍数是针对最高灵敏度的。如有需要可以用稀释倍数更高的样品进行接种测试片。不要使用含有柠檬酸盐或硫代硫酸盐的稀释液。 。 以每 7 秒 30cm 的速度左右摇晃 25 次以混合所有的溶液。 搅拌或者快速匀浆固体物2 分钟以使其混合均匀。 （a）全脂牛奶、2牛奶、1牛奶、脱脂牛奶和未加工牛奶将 1mL 经过稀释或者未经稀释的产品分布在大肠菌群测试片 B（a）上，未经稀释的测试片上菌群数就是每克样品中的菌落数。 （b）冰淇淋粉和巧克力牛奶以 1：10 的比例稀释产品11g/99mL 稀释用水，B（f）。取 1mL 分布于干膜大肠菌群测试片 B（a）上培养。将菌落数乘以稀释倍数以获取每克样品中的菌落数。 （c）黄油和人造黄油和（b）的操作相同，稀释液事先加热至 4045。不要使用柠檬酸盐缓存液均质样品。 （d）酸乳、酸奶和冷冻酸奶和（b）操作相同。稀释后使用 1M 的 NaOH 溶液将 pH 值调制 6.5 到 7.5， B （e）（大约为 0.1mL/g 产品） （e）酸奶油，酸奶，速溶脱脂奶粉，乳清粉和相关产品和（b）操作相同，不要使用柠檬酸盐缓冲液来均质样品。 （f）非乳制品在无菌情况下称取 50g 的测试样品置于搅拌器中。加入 450mL 稀释剂，并以 16000 至 18000rpm的转速搅拌 2 分钟，使其均质。按要求用 1M 的 NaOH 溶液 B（e）将稀释后的溶液的 pH 值调整到 6.5 至 7.5（样品均液浓度大约为 0.1mL/g） 。如果全部的测试样品质量小于 50g，称取测试样品并加入无菌稀释液，以 1:10 的比例进行稀释。除非另有说明，所有的十倍递减的稀释溶液都以 90mL 水和前一次溶液中的 10mL 溶液相混合制取。 D. 分析分析 将干的 Petrifilm RCC 板 B（a）置于水平表面,。提起上层膜，将 1mL 样品均液接种于测试片的中心。小心将上层膜覆盖在接种面上。向塑料压板（平面向下）的中心轻轻施压，将样品均液均匀地分布于 20cm2的生长区域。并将测试片静置以使凝胶固化。将测试片在 351下培养24 小时。将测试片水平朝上放置于培养器中。每叠不要超过 20 个。在培养结束之后 1 小时内及时计数。 使用标准菌落计数器来计算 Petrifilm RCC 板中的菌落数，或者使用其它照明放大器。不要对边缘泡沫塑料上的菌落计数，因为它们没有受到培养基的选择性作用。不要将可能出现的人造气泡计算在内。确认的大肠菌群将会在 824 小时的培养之后以带气泡的红色菌落。它们是带有一个或者多个气泡的红色菌落，而且有些带有黄色酸性区域，有些没有。选择有 10150 个菌落的测试片。如果所有的测试片都没有 10 个以上的菌落， 精确记录稀释倍数最小的样品均液的原始数。如果所有测试片的菌落数都大于