生物,动物,本科生毕业论文.doc

骨骼肌TEF1转录因子下游靶基因Nudt6和Tcta的克隆、测序、SNP检测及性状关联分华中农业大学动物科学专业2006级1 前言1.1 研究背景骨骼肌的生长速度是猪的生产性能的主要决定因素之一，动物的产肉力与肌纤维细胞的数量、长短、横截面积和生长密切相关（Oksbjerg et al.，2004）。因此加快肌肉的生长速度和提高瘦肉率一直都是猪遗传改良研究的重点。但由于猪的产肉性状大多是由多基因控制的数量性状，通过常规选育难以进一步提高。因此结合分子标记辅助选择进行猪育种改良，可以为猪肌肉经济性状的遗传改良研究注入强大的新动力，已成为一种趋势。近年来，猪的分子遗传育种取得了很大的进展，许多新基因被分离克隆，并与猪肉质性状、胴体性状和生长性状进行了关联分析，从而为现代分子遗传标记应用于猪遗传育种提供了分子遗传基础，并推动了猪育种的发展。因此对重要经济性状候选基因的分离克隆和研究，为加快我国养猪业的发展、加速猪新品种的培育具有非常重要的意义。猪的生长性状是提高养猪生产效率的重要基础，是当前养猪业中的一个重点。而猪的生长性状关键在于肌肉的生长，因此对肌肉生长相关的候选基因的研究成为必要。1.2 TEF1在肌肉生长发育中的作用肌纤维细胞是由胚胎发育早期的成肌细胞经过增殖和肥大而形成。虽然肌肉的发育和生长是一个非常复杂的过程，但主要分为三个阶段，即成肌细胞（myoblast）分化决定阶段、成肌细胞的形成与分化阶段和肌管（myotube）形成阶段（Scott, 2003）。骨骼肌不同阶段的演化涉及到许多细胞因子（如调节因子，成肌决定因子，细胞周期作用因子和增强因子等），还包括细胞凋亡过程。目前已经鉴定的调节因子包括转录因子、信号分子及生长因子。TEF1是一个重要的转录因子，在肌肉特异基因的表达中起着比较重要的作用，TEF1的TEA结构域不但能与肌肉特异基因的M-CAT元件作用，还能与其他因子的MADS结构域作用调节其它的肌肉基因的表达。（邱海芳，2009）1.3 两个拟分离基因的研究进展本实验室的邱海芳博士（2009）已经运用ChIP-on-chip（染色质免疫沉淀技术，chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）技术钓取了小鼠TEF1转录因子在肌肉组织中的下游靶基因，并进行了GO分析和调控通路分析。筛选了745个靶基因。其中大部分基因参与了转录调控相关的细胞过程，在肌肉生长发育过程中发挥了重要作用。本实验选取邱海芳博士ChIP芯片中Nudt6和Tcta基因进行研究，。1.3.1 Nudt6的研究进展核苷二磷酸连接X型基元6基因（nudixtypemotif6，Nudt6），又叫GFG基因；属于Nudix(nucleosidediphosphatelinkedmoietyX)水解酶超家族。这些水解酶的主要底物是连接了X成分的核苷二磷酸（nucleosidediphosphates）（X代表任意氨基酸）。Nudt6基因人定位于4q28.1，有两个转录本，长约1kbp。在小鼠中，Nudt6定位于3号染色体，长约1.1kbp。在结构上，Nudt6基因与bFGF在3端有460个左右核苷酸有互补性。它编码一个35kDa的GFG蛋白。GFG蛋白在多种组织表达，但是目前关于其具体作用还知之甚少。Nudt6基因的mRNA是FGF2反义链转录而来，所以又叫反义FGF。FGF的反义转录本1989年首次在非洲蟾蜍中鉴定。Nudt6基因在转录后水平调控FGF2基因的表达。在细胞内，FGF2基因的正义链mRNA和反义链mRNA以稳定的双链结构存在。Nudt6基因在转录后直接结合到FGF mRNA的3非翻译区端，形成双链结构。而3端非翻译区在决定bFGF的mRNA稳定和翻译起始有重要作用。所以，反义链mRNA可以稳定FGF2基因的mRNA，调控FGF2的翻译。在mRNA转录水平，Nudt6基因不影响FGF2基因，但是可以抑制细胞内的FGF2蛋白，而且这种转录后的调控作用直接和Nudt6的mRNA表达量正相关。过表达其RNA可以抑制细胞内总FGF2，核内聚集FGF2减少。细胞周期停留在G期，延迟进入S期，达到调控细胞周期，控制发育的作用。在某些肿瘤病人，Nudt6的表达水平与提高生存率，降低复发率有重要联系，特别是bFGF表达异常的病人。朱纲华等（2007）研究了Nudt6在小鼠内耳的表达，发现Nudt6和FGF2在耳蜗损伤后修复过程中起着重要作用。Shuo Cheng Zhang等（2007）研究了Nudt6在人的多种组织以及食管癌中的表达，发现Nudt6和FGF2的过表达可以减少食管癌的复发率。而在猪上面还没有关于该基因的报道。1.3.2 Tcta的研究进展1995年Aplan等在T细胞白血病易位断点t（1；3）（p34；p21）克隆并鉴定了一个新的基因，并命名为Tcta（T细胞白血病易位相关基因），定位到3p21。Tcta的mRNA在各种组织中都有表达，尤其在肾脏中表达最高。Tcta基因的功能还不清楚。但是在进化过程中，从低等真核生物（如果蝇）和脊椎动物中，各物种的Tcta基因高度保守。从ATG起始密码子开始，Tcta基因仅有103个氨基酸残基的开放阅读框，编码了相对分子质量11300的蛋白质，这个蛋白质不与任何之前报到的蛋白质同源。在4个小细胞肺癌细胞系的Southern杂交中，有3个细胞系Tcta表达减弱，表明Tcta基因的两个拷贝中，有一个缺失了。Tcta的mRNA在人的正常组织中广泛表达，预示着它不可能涉及特定细胞的变异。Tcta的mRNA在肾脏的表达水平比其他组织的高，预示它编码的蛋白质有横跨膜的作用，但还没有发现明确的特征。2005年又报到Tcta可以在蛋白质组图谱水平，影响SMAD4蛋白。2009年 Shigeru Kotake等发现Tcta蛋白是人破骨细胞生成必须的。但是Tcta的功能依然不清楚。1.4 SNP在猪育种中的应用单核苷酸的多态性（SNP）是指由于一个核苷酸突变导致的DNA序列多态性，包括单碱基的转换(同型碱基的置换，一个嘧啶置换另一个嘧啶；一个嘌呤替换另一个嘌呤)、颠换(异型碱基的置换，即一个嘌呤替换另一个嘧啶；一个嘧啶置换另一个嘌呤)，以及单碱基的插入或缺失等。理论上讲，SNP 既可能是二等位多态性,也可能是3 个或4 个等位多态性，但实际上，SNP具有偏爱性，后两者非常少见，几乎可以忽略。SNP几乎遍布于整个基因组，非常的丰富。据估计，在人类基因组中，任何2 个同源染色体间，估计平均每1000个碱基对就有1个SNP。NCBI数据库dbSNP Build 131版中人类（Homo sapiens） SNPs 已有32,017,159个，dbSNP Build128版中猪（Sus scrofa）SNPs已有374,379个/projects/SNP/snp_summary.cgi。单核苷酸多态性（SNP）是继限制性片段长度多态性和微卫星之后，新发展起来的第3代分子标记，在人类和动物基因组中普遍存在。具有密度高、双等位型标记、片段较短、遗传稳定性强、易实现高通量自动化检测和分析、在DNA分子上分布不均匀等特点。作为新的遗传标记，SNP已广泛应用于基因标记、基因定位与克隆、性状关联分析、遗传多样性分析、基因组结构与功能研究、连锁图谱的构建、医学研究和遗传改良等领域。在动物育种的过程中，为了提高效率，人们一直致力于寻找一些经济、实用、可靠的分子标记。目前，建立在DNA序列基础上的分子标记,具有共显性、不受环境和发育阶段的影响等优点，已经开始在动物育种中运用。由于猪基因组计划的启动与运作，并已建立了大量的数据库，公共数据库中已有大量的表达序列标签（ESTs）、序列标签位点（STSs）、cDNA文库和基因组测序公开的序列等信息。通过Internet上数据库的序列对比程序（如/BLAST/）对这些来源于不同实验室不同物种不同个体的序列进行比较，删除由测序造成的碱基错读，就可得到候选SNP甚至真实存在的SNP。因为可大大降低检测SNP的成本，这种策略已被用于构建SNP标记（Picoult et al., 1999）。而随着SNP标记的发现和其定位，家畜遗传连锁图谱标记密度将日益升高，这将为家畜育种提供前所未有的便利工具。随着标记密度的升高，基因组扫描能够将QTL定位于更小的染色体区域内，从而为新的主基因的发现和定位克隆打下良好的基础；高密度SNP遗传图谱的出现使我们可以更精确的进行标记辅助选择（MAS） 和标记辅助导入（MAI），降低或消除目的基因之外的遗传背景对这些技术带来的不良影响。而且在不同的动物品种中，SNP的频率分布存在差异，这些差异可以代表某一品种间的遗传差异。因此，研究SNP有助于解释个体的表型差异，不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。1.5 本研究的目的与意义21世纪猪育种目标是在保持和适度提高瘦肉率的前提下，继续提高瘦肉组织的生长速度和饲料转化率。（熊远著，2000）。骨骼肌生长速度是猪生产性能的主要决定因素。组成动物肌肉的结构单位是肌纤维，此外还含有一定数量的脂肪和结缔组织。而肌纤维的数目和大小则主导着猪肉的产量。而且肌肉结构中的脂肪和结缔组织含量及分布与肉品品质关系密切。曾勇庆等(1998)发现莱芜猪宰后僵直肌肉肌节长度与肉品嫩度间呈正相关，肌节长度愈大，肌肉愈细嫩。红肌纤维含量多的肌肉有较长的肌节。肌肉表面纹理是肌束大小排列的表现，肌束内肌纤维愈细，肌纤维密度就愈大，则肌肉表面纹绒状，肉品品质优良，其肉质愈鲜嫩。因此骨骼肌的生长发育一直以来都是猪遗传改良工作者研究的重点，但骨骼肌的生长发育过程十分复杂，涉及大批基因的表达及网络式调控。本研究以人中影响肌肉生长发育的两个基因作为侯选基因，在猪中进行研究，以达到以下目的：（1）通过比较基因组学和生物信息学方法克隆出两个基因的mRNA序列，并通过测序寻找潜在SNP位点，进一步分析SNP位点与经济性状间的关联。（2）在我室与通城县畜牧局合作构建的试验群体中，进行标记性状关联分析。上述工作的意义在于：通过对猪肌肉生长发育相关基因的克隆与遗传分析，可以丰富猪基因物理图谱中基因标记信息，为猪分子育种提供基因素材，为标记辅助选择提供分子标记。2 材料2.1 DNA样品用于基因分离的RNA来自通城猪、瑞典长白和英国大白，样品采自通城原种猪场，RNA已由本研究室提取，于- 20保存备用。用于基因性状关联分析的试验猪群是由我室与通城县畜牧局和种畜场合作组建的通城纯种群体（29头）、大白（30头）、长白（27头）、长大通（28头）和大长通（27头）。基因组DNA 由本室从血液中采用酚仿抽提法得到，于20保存备用。2.2 主要仪器设备主要仪器设备包括Personal Cycle PCR仪（德国Biometrra公司）、梯度PCR仪（德国Eppendorf）、MJ-100PCR仪（美国MJ公司）、美国产超低温冰箱，英国Syngene公司产凝胶成像系统、意大利产F100 Icematic制冰机、国产超净工作台、自动双重纯水蒸馏器、高压灭菌锅、自动摇床、国产冰箱、高压灭菌锅、微量移液器、电子天平、国产恒温培养箱和北京六一仪器厂的各种型号的电泳仪和电泳槽。2.3 主要试剂（1）PCR反应所需Taq酶、10PCR buffer、2PCR buffer和dNTPs等从上海伯奥生物科技公司购买。（2）100bp DNA ladder和限制性内切酶为MBI Fermentas公司产品；（3）Oligo dT11和其它引物均由北京奥科生物公司合成；（4）0.2mL及0.5mL EP管、水饱和蒸酚、dNTP、电泳用的琼脂糖、异丙醇和氯仿、氯化钠、乙醇、矿物油、等其他试剂均为国产；（5）琼脂糖凝胶DNA快速纯化回收试剂盒由原平皓（天津）生物技术有限公司生产。（6）三羟甲基氨基甲烷（TrisBase）、二水乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na22H2O）购自Sigma公司。（7）低熔点琼脂糖购自北京华绿渊生物技术发展中心。2.4 主要试剂的配置（1）50TAE储备液：将242 g Tris碱溶解到750 mL双蒸水中，加入57.1 mL乙酸和100 mL 的0.5 mol/L 的EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000 mL；（2）LB液体培养基：称取0.5 g酵母浸出物，1g胰蛋白胨，1 g NaCl，溶于90 mL 双蒸水中，搅拌完全溶解后，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH将pH值调至7.0，定容至100mL，120摄氏度30分钟高压灭菌后备用；（3）LB固体培养基：加1.5 g琼脂粉到100 mL LB液体培养基中，120摄氏度30分钟高压灭菌后，在超净工作台上铺平板，每板约5 mL ，冷却后备用；（4）5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：将15.1 g Tris碱和94 g甘氨酸融解到900 mL双蒸水中，然后加入50 mL 10 (m/V)的SDS贮存液，双蒸水定容到1L；（5）氨苄青霉素（Amp）：为Sigma公司公司产品，用灭菌双蒸水溶解成储存浓度50 mg/mL，-20保存备用；（6）琼脂糖电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，25%聚蔗糖水溶液；2.5 载体和菌株pMD18-T载体由宝生物工程（大连，Takara）有限公司生产大肠杆菌DH13和BL21为华中农业大学动物科技学院病毒室惠赠。2.6 主要分子生物学软件、统计软件和相关网站（1）Primer 1.0和Premier 5.0用于引物设计，Premier 5.0用于酶切位点分析， DNAstar 5.01用于DNA序列处理，Chromas 2.22用于测序峰图分析。数据统计分析软件是SAS 8.0。（2）GenBank: / （可满足各方面的序列数据库查询要求）（3）Entrez系统： /gquery/gquery.fcgi?itool=toolbar （提供整体信息的搜索和访问）；（4）PubMed数据库：/entrez/query.fcgi?db=PubMed （参考文献的追踪和获得）；（5）BLAST程序：/BLAST/ （序列比对）3 方法3.1 猪 Nudt6 和 Tcta 基因的分离方法3.1.1 猪EST信息的获取和整理表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）序列是基因表达的短cDNA序列（通常只有300-500bp），通常来源于不同的物种不同的组织，它们携带着完整基因的某些片段的信息。到2010年5月，GenBank数据库中人的EST序列已达到8301475条，猪的EST序列已达到1621000条，它已经覆盖了猪基因组的大部分。利用计算机来协助克隆的第一步是必须获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有效途径是以目的基因为种子序列，搜索其在其它物种中的同源序列。因此，本研究从GenBank数据库中寻找所需的人和小鼠基因的cDNA的参考序列。并以此为信息探针（种子序列），利用NCBI中的Nucleotide-nucleotide BLAST工具（/BLAST/），在GenBank EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性大于85%以上的，长度大于100bp的猪的EST全部下载到电脑上，进行克隆研究。如图3-1中所示。3.1.2 引物设计以拼接的EST序列作为引物设计的模板序列，利用生物学引物设计软件Primer Premier 5.0，手动调整引物位置，用软件自动分析引物结构、GC含量、Tm值等参数，并对引物对给出整体评分，确保有效引发与扩增序列保守两相兼顾。设计了分离两个基因部分序列的引物，每个基因设计了两对引物。用于分离两个基因的引物见表3-1，引物由武汉思特竞生物技术公司合成。表3-1 用于分离基因的引物信息与PCR扩增条件Table 3-1 The primer information and PCR conditions used for isolating the four genes基因符号Gene symbols引物序列Primer sequences(5-3 )扩增片段长度Size (bp)退火温度Tann (C)Nudt6PNuCS1：GCATCTCGGTGAAACTAGACPNuCA2：CGAATACTCAGGAGGGACAT45454PNuCS2：AGCCTGGAGAAGATATTGGAPNuCA1：ATAGCATTTACCATTATCCAGT65054TctaPTcCS1：CGCCACAACTGCCAACTCTGPTcCA2：TGTGTCCAGGCCAGGATTCC94063PTcCS2：GGAATCCTGGCCTGGACACAGPTcCA1：CCTGATGCTGAGTGTGGTGTCG940653.1.3 反转录反应（RT-PCR）将已提取的通称、长白、大白的RNA（RNA已经由本实验室制备本在-20冻存）稀释至1 g/L。cDNA第一链的合成的反应体系是50 L，将已稀释RNA取2 L（含RNA2 g）于灭菌的Ep管中，加入10 M的oligod(T)11 5 L，加入DEPC处理过的H2O至总体积15 L。混匀稍微离心，于70温育（以解除RNA的二级结构）5min后，立即置于冰上12min防止二级结构的重新生成。然后加入35 L的其他组分，包括：M-MLV 1 L (40 U)，5buffer 10 L，dNTP 2.5 L，1 L Rnasin (40 U)和DEPC 处理H2O 21 L.混匀离心，置于37温育1小时，95，5 min灭活。反转录的cDNA于-20保存。3.1.4 PCR扩增 PCR反应体系PCR反应总体积为20L，扩增总体系10 L，其中矿物油10L。扩增模板是肌肉组织总RNA反转录的cDNA，且每对引物都要以通称、长白和大白三个品种的cDNA作为模板扩增。扩增总体系10 L包括25ng/L DNA模板1.00L ，10 pmol/L正反向引物各0.20L，2 U Taq DNA聚合酶0.1 0L，10PCR缓冲液（含20mol/L Mg2+）1L（或2PCR缓冲液5L），加双烝水至10 L。 PCR反应程序引物对（PNuCS1PNuCA2）的反应程序为95，5min；38(94，30 s；54，30 s；72 ，25 s)；72 ，7min；15，2min。引物对（PNuCS2PNuCA1）的反应程序为95，5min；38(94，30 s；54，30 s；72 ，30 s)；72 ，7min；15，2min。引物对（PTcCS1PTcCA1）的反应程序为95，5min；38(94，30 s；63，30 s；72 ，40s)；72 ，7min；15，2min。引物对（PTcCS1PTcCA1）的反应程序为95，5min；38(94，30 s；65，30 s；72 ，40s)；72 ，7min；15，2min。 PCR扩增产物检测制备1-2%琼脂糖凝胶，将待检DNA样品(2L)和琼脂糖上样缓冲液混合后加入琼脂糖凝胶点样孔，100-120V电压电泳至目的带可以区分，紫外分析仪下观察结果，并用凝胶成像系统拍照。3.1.5 PCR产物的纯化、克隆和测序 PCR产物回收纯化在紫外灯照射下，从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5 mL Ependorff管中，加入足够的溶胶液（约3倍于凝胶），于70温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是 ：将融化的凝胶液取出，放入另一个干净的1.5 mL吸附柱中。12000r/min ，离心2分钟；倒掉下层溶胶液，加入700L漂洗液，12000r/min ，离心1分钟；倒掉下层漂洗液，加入500L漂洗液，12000r/min ，离心1分钟；倒掉下层漂洗液，12000r/min ，离心3分钟；将吸附柱取出放入另一干净的1.5 mL Ependorff管中，打开吸附柱管盖，室温下放置10分钟左右，使得乙醇完全挥发，以免影响后续试验。取35-50L提前预热的双蒸水（50-60C预热），悬空添加到吸附膜中间，12000r/min ，离心2分钟。回收产物于-20C保存。 纯化PCR产物与pMD18-T载体的连接连接反应总体积是10L，其中包括5L 2Solution，0.5 L的pMD18-T载体，3L的纯化PCR产物，0.5 L的T4连接酶。在4冰箱中，过夜（约12 h）连接。 连接产物的转化在超净工作台上，取200 L感受态细胞到1.5 mL Ependorff管中，加入5 L的连接产物并混匀，在冰上静置30 min（冰浴过程中不能摇动Ependorff管），42 热激90 s（热激过程中不能摇动Ependorff管），取出后冰浴23 min（冰浴过程中不能摇动Ependorff管），加入500 L无抗生素的LB液体培养基，37缓慢振荡（200-220 r/min）培养45分钟后，取出低速离心（6000 r/min）弃去500 L上清液，轻轻摇匀，取出匀液涂布于已提前4 h涂布了含浓度为60 g/mL 氨苄青霉素的琼脂平板上，37平放1 h后倒置培养12 h。 PCR扩增鉴定阳性克隆取1L菌液为模板进行PCR扩增，并对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果与预计完全相同并无杂带者，其菌液中为所要目的重组质粒。 序列测定与比对分析将含有PCR扩增鉴定为阳性克隆的重组质粒的菌液送至北京奥科生物技术公司进行序列测定。测序公司返还的序列文件，用SeqMan软件来拼接正反向测序序列，使之成为一段包含正反引物测序序列的完整DNA片断序列。对于一些较长的测序片段，在550bp以后部分的测序质量有所下降，容易出现漏读与错读的错误，不能单凭序列文件给出的结果直接拼接，必须用Chromas 2.22软件来浏览测序峰图，仔细核对峰图和序列，待修正测序错误后才可进行序列拼接。之后，利用Seqman软件，对同一对引物的、不同品种（通称、长白和大白）的测序结果进行比对分析，将没有双峰且具有不同碱基的位点，暂定为突变位点。待进一步分析。3.2 PCR-RFLP方法检测猪Nudt6多态性RFLP是由于碱基的变异可能导致酶位切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差异。这种由于限制性内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism，RFLP）。RFLP反映了常见的个体间DNA的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP是发展最早的分子标记技术，凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。3.2.1 重新设计引物，进行PCR扩增根据找到的突变位点，重新设计引物。并根据突变位点，购买合适的限制性内切酶，扩增出包含突变位点的DNA序列。表3-2 用于检测基因多态的引物信息与PCR扩增条件Table 3-2 The primer information and PCR conditions used for detection genes SNPs基因符号Gene symbols引物序列Primer sequences(5-3 )限制性内切酶扩增片段长度Size (bp)退火温度Tann (C)酶切温度(C)Nudt6NuSNP2S：AACTGCCAGACAATTACAAAACNuSNP2A：TCATGAAAATCACAGGCATTAGNlaIII17256373.2.2 酶切取出3LPCR产物加入50L EP管中，加入1.9L双蒸水，5L 2Buffer以及0.1L限制性内切酶，在相应酶切温度下酶切12小时。3.2.3 基因分型用3-4%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，凝胶成像系统成像，记录基因型结果。3.3 多态标记与性状的关联分析方法将记录的基因型信息输入SAS9.0统计软件,利用最小二乘法拟合线性模型进行分析。4 结果4.1 PCR扩增产物检测设计引物后，以大白猪，长白猪和通城猪的肌肉cDNA为模板，进行PCR扩增，将所得的PCR产物回收。PCR扩增产物经1%的琼脂糖胶凝胶电泳检测，结果如下图。从图中可以看出没有杂带出现，因此可以用于连接转化。4.2 SNP检测结果从猪cDNA中扩增