IPTG诱导外源基因表达

IPTG诱导表达原理及操作步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （LuriaBertani）培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 m 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，20 保存。( 3 ) l 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 溴酚蓝10 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF）。（3）10 mg / mL 溶菌酶。（4）脱氧胆酸。（5）1 mg / mL DNase I。2 ）超声破碎法 ( 1 ) TE 缓冲液。 ( 2 ) 2SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 溴酚蓝20 甘油实验方案1、外源基因的诱导表达 (1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。 (2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。 (3）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。 (4）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。 (5）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 L 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1 ）细菌的裂解常用方法有： 高温珠磨法； 高压匀浆； 超声破碎法； 酶溶法； 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法 、 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；-1,3 -葡聚糖酶；-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为： 4 ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100mL）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。目的蛋白的诱导表达和纯化(1)菌在含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB培养基中37 振摇培养过夜(2)按10%的接种量转接入新鲜 LB培养基，250 rpm, 37摇菌至A600=1(3)加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37继续通气培养45 h(4)分别于2h、4h各取1.5 mL菌液，7734g离心30s收集菌体(5)菌体加入H2O 60 L，剧烈振荡混匀，再加入4样品缓冲液20 L，100，5 min；7734g离心5 min；(6) %SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色后观察诱导结果(7)大规模培养细菌,诱导表达目的蛋白,离心,收集菌体,将菌体重悬于lysis buffer,超声破菌(8)离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDSPAGE(9)可溶的目的蛋白直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析纯化. 以包涵体形式存在的表达产物. 用N十二烷基肌氨酸钠将沉淀蛋白质变性过夜，经缓慢透析去除N十二烷基肌氨酸钠，令蛋白复性后，用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行亲和层析纯化(10)先以 5 10个柱体积 (CV) PBS缓冲液平衡柱, 流速 1.5 ml/min;样品液 10 ml上样, 流速为 0.5 ml/min, 用 5 10 CV缓冲液洗脱未结合的物质; 5 CV的洗脱液洗脱目标蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脱液。 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物, 检测表达产物的分子量及纯化效果。重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化将阳性重组质粒转化至 BL21 中, 选取多个重组菌落接种 LB液体培养基中 37 振摇培养过夜,按 1100 比例转入新鲜 LB培养基, 培养至 OD值为 1.0 时, 加入终浓度为 1.0 mmol/L的 IPTG继续诱导培养 3 h。离心, 收集菌体。将诱导后的菌体重悬于 lysis buffer, 超声破碎后离心去沉淀, 收集样品液。 GSTrapFF 柱亲和层析纯化重组蛋白。 先以 5 10个柱体积 ( CV) PBS缓冲液平衡柱, 流速 1.5 ml/min;样品液 10 ml 上样, 流速为 0.5 ml/min, 用 5 10 CV缓冲液洗脱未结合的物质; 5 CV的洗脱液洗脱目标蛋白, 流速 1.5 ml/min, 收集洗脱液。 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE) 鉴定表达产物, 检测表达产物的分子量及纯化效果。铺板培养12h后挑取阳性克隆 ,37、300g培养至菌液A260=0.6时 , 加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。分别于2h、4h各取菌液100L, 离心收集细菌沉淀 , 行SDS-PAGE电泳 , 考马斯亮蓝染色后观察诱导结果。大量菌液37 1mmol/L IPTG诱导表达4h后回收细菌沉淀。将诱导的蛋白用纯化包涵体的方法进行初步纯化 , 然后进行SDS-PAGE电泳 , 回收包涵体.将切下的目的蛋白条带用电洗脱方法回收。GST亲和层析原理谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，简称GSTs，EC2.5.1.18）广泛存在于动物和人体的各种组织，是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同功酶，分子量为23-29KD。GST蛋白能与亲和介质上的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，再用还原性谷胱甘肽竞争GST上的结合位点将GST蛋白洗脱下来，从而达到纯化的目的。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20保存。Lysis buffer （50ml）1)2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris，pH8.0 3)90ml distilled water .操作步骤1)挑一个克隆至2ml LB液中（Amp+ ）2)37振摇至OD600值约为0.6 3)将2ml菌液加入100 ml LB中 4)37振摇至OD600值约为0.6 5)加入IPTG至终浓度为1mM 6)继续摇34h 7)离心（5000 rpm，5min，4）8)用10柱体积的lysis buffer悬浮细菌 9)超声破碎细胞 10)离心（12,000rpm,15min,4），取上清 11)用滤纸过滤 12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱 13)5柱体积的lysis buffer洗层析柱 14)样品过柱 15)5柱体积的lysis buffer洗层析柱 16)3柱体积的elution buffer洗脱蛋白