高级生化复习资料习题集

名词解释：亲和层析：蛋白质分子能对配基专一性地结合成复合物，改变条件，又能分离，利用这种特性而设计的一种层析技术。蛋白质完全水解：即将所有的肽键都打断，使蛋白质完全裂解为氨基酸。蛋白质部分水解：即将蛋白质的部分肽键打开，进而部分地分离出所需氨基酸。高效液相层析：采用大幅度降低支持物的颗粒度，同时增加压力，以维持必要的流速，而设计的层析方法。超二级结构：由若干相邻的二级结构单元结合在一起，彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件。结构域：对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链在超二级结构的基础上组装成两个或两个以上的相对独立的三维实体，再缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体即蛋白质的盐溶：中性盐对蛋白质的溶解度可产生两种影响，低浓度时可增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。盐析：当盐的浓度增高时，如饱和和半饱和状态，蛋白质溶解度降低，从水溶液中沉淀出来。密度梯度区带离心：蛋白质颗粒的沉降速度与分子大小和密度相关，在具有密度梯度的介质中离心时。质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度中。蛋白质组：一个细胞或组织或机体所包含的所有蛋白质，现定义为基因组表达的全部蛋白质。具有三种含义：一个基因组、一种生物、一种细胞所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。噬菌体展示技术：是将外源的DNA通过基因工程技术克隆到噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。外源基因产物在过柱时，如柱上含有目的蛋白质，则可特异性结合相应抗体。生物信息学：在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交差学科。是为理解各种数据的生物意义，运用数学和计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播和解析的科学。使蛋白质沉淀的方法：1）、盐析法：中性盐对球状蛋白质的溶解度可能产生两种影响，低浓度时可增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。当盐浓度增大时，如饱和或不饱和状态，蛋白质溶解度降低，从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析的而主要作用是由于大量的中性盐的加入，盐离子与水这种偶极分子作用，使水分子活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，导致蛋白质水合程度的减少，从而使蛋白质溶解度降低。2）、有机溶剂法：有机溶剂中有较低的介电常数，根据库伦定律，介电常数降低，将增加两个相反电荷之间的吸引力。在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在，这时如果添加有机溶剂，使蛋白质溶液的介电常数减小，增强偶极离子间的静电引力，从而使蛋白质分子聚合而沉淀。有机溶剂自身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也使蛋白质分子变得不稳定而沉淀出来。3）、蛋白质沉淀剂法：向蛋白质水溶液中加入沉淀剂，使一些杂蛋白或粘多糖发生沉淀，这些沉淀物可以通过离心分离而除去。4）、等电点沉淀：不同的蛋白质有不同的等电点，利用不同蛋白质等电点的差异，调节溶液pH等于所需蛋白质的等电点，则所需蛋白质结絮沉淀。氨基酸个性研究的重要性解释蛋白质结构与功能的关系， 从一级结构预测高级结构氨基酸个性了解得越深刻，在根据一级结构预测蛋白质的立体结构时，考虑问题也就越全面，预测的正确性也就越高。维持空间构象的因素1 共价键蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或核酸）构成共价键，共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑制作用。2 非共价键生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成，而且具有选择性的识别。共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间，决定分子的基本结构，是分子识别的一种方式。而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。1)静电作用静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的各种静电吸引力。酶、核酸、生物膜、蛋白质等生物大分子的表面都具有可电离的基团和偶极基团存在，很容易与含有极性基团的底物或抑制剂等生成离子键和其它静电作用（1)离子键生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。(2)离子偶极作用分子中O、S、N和C原子的电负性均不相等，这些原子形成的键由于电负性差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用.离子-偶极相互作用一般比离子键小得多，键能与距离的平方差成反比，由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会影响作用强度。(3)偶极-偶极相互作用两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极两个偶极间的作用。偶极偶极相互作用的大小，取决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置。这种相互作用在水溶液中普遍存在。它的作用强度比离子偶极作用小，但比偶极诱导偶极作用大2)氢键氢键的形成 氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊形式的偶极偶极键。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。 氢键的大小和方向 氢键的键能比共价键弱，比范德华力强3)范德华力这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.40.6nm时，这种力就表现出较大的集合性质。范德华力包括引力和排斥力。4)疏水作用疏水作用是指极性基团间的静电力和氢键使极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团相互聚集所产生的能量效应和熵效应。蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域，这是由构成它们的氨基酸侧链上的烷基链或苯环在空间上相互接近时形成的。高分子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构蛋白质的时空特性1.蛋白质的空间性 信号肽对蛋白质或肽链的定向传送已成为蛋白质研究的一个很重要的方面。 特征结构：溶酶体酶分子中的甘露糖-6-磷酸 酶原及酶原激活 同形异位突变2.蛋白质的时间性 肿瘤发生时出现胚胎分化早期所出现的Pr，如肝癌出现的甲胎蛋白。 细胞周期不同时期蛋白质表达的调控是又一个重要研究领域。分离纯化依据的性质1大小蛋白质的大小各不相同，可从含几个氨基酸的小肽（几百个Da）至含10 000多个氨基酸（上百万个Da）的巨大蛋白质不等。多数蛋白质的分子量在10 000150 000Da之间。2形状蛋白质形状有近似球形的，也有很不对称的。在离心、凝胶过滤或凝胶电泳过程中都会受到形状的影响。3电荷蛋白质的静电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷的总和。一蛋白质中，若天冬氨酸和谷氨酸残基占优势，在pH7.0时带净负电荷，则称之为酸性蛋白；若赖氨酸和精氨酸残基占优势，则认为是碱性蛋白质。4等电点等电点（pI）是蛋白质上净电荷为零时的pH值，由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基数目和滴定曲线所决定。5电荷分布 电荷的氨基酸可均匀地分布于蛋白质的表面，亦可成簇地分布，使某一区域带强的正电荷而另一区域带强负电荷。这种非随机的电荷分布可用来通过离子交换层析来分离蛋白质。6疏水性多数疏水性氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些可见于表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分级分离的能力。7溶解度蛋白质在不同溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（300 mg/ml)不等。影响蛋白质溶解度的因素包括pH、离子强度、离子的性质、温度和溶剂的极性。蛋白质在其等电点处一般较不易溶解8密度 多数蛋白质的密度在1.31.4g/cm3之间。分级分离蛋白质时一般不用这个性质。但是，在含有大量磷酸盐（如卵黄高磷蛋白，密度为1.8）或脂质部分（如脂蛋白，密度为1.03）的蛋白质，与一般蛋白质在密度上确有不同，可用密度梯度法将它们从大部分蛋白质中分离出来。9配体结合能力 有许多酶能相当紧地域底物、效应分子、辅助因子和DNA模板。可利用亲和层析分离10金属结合能力 有许多酶能与某些金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+)紧密结合。主要是其半胱氨酸或组氨酸残基可与金属离子作用，可通过金属离子螯合柱将酶固定11可逆性缔合 在某些溶液条件下，有一些酶能聚集成二聚体、四聚体等。如大肠杆菌RNA聚合酶在0.05mol/L NaCl溶液中形成二聚体，在0.3mol/L NaCl溶液中为单体，可利用这一性质，相继在不同条件下按大小进行分级分离。12. 翻译后修饰 许多蛋白质在合成后要通过加入糖基、酰基、磷酸基团或种种其他部分来进行修饰。这些修饰提供了可用于分级分离的依据。如糖蛋白能与含有外援凝集素的柱子结合，外源凝集素是一类能牢固地与某些糖基部分结合的分子。13. 特异性序列或结构 氨基酸残基在蛋白质表面上的精确的几何表象可用来作为分离方法的基础。例如，常可得到只能识别蛋白质上的特定部位（表位）的抗体。把只能与待分离蛋白质结合的单特异性抗体连接于填料上，可制备成免疫亲和柱。14. 非寻常性质 除上述各种性质外，某些蛋白质还有一些不寻常的性质，如不寻常的热稳定性、抗蛋白酶解的抗性等。例如大肠杆菌碱性磷酸酯酶的纯化，将细胞提取物加热后离心去除凝结的蛋白质，然后用蛋白酶处理含有磷酸酯酶的上清液，该酶消化剩余的杂蛋白，留下基本纯净的碱性磷酸酯酶。15.基因工程构建的纯化标记 随着基因工程技术的进步，克隆编码某一蛋白质的cDNA已变得比较容易。通过改变cDNA而在被表达蛋白质的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的“标记”可用来作为一种有些的纯化依据。最通行的标记之一是在蛋白质的氨基端加上610个组氨酸，这样可以使肽链能与Ni2+螯合柱紧密结合，经洗脱，再用游离咪唑洗脱或通过将pH降至5.9，使组氨酸充分质子化，与Ni2+分离而使蛋白质得以纯化。分离纯化的一般步骤（一）前处理1、选材2、破碎3、混合物的分离植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。（二）粗分级分离（1）盐析（2）等电点沉淀（3）有机溶剂分级分离（4）超滤（5）凝胶过滤（6)冷冻干燥当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。（三）细分级分离 一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。3.细分级分离结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 4. 结晶方法(Crystallization Techniques) 4.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2l包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。 4.2 液-液扩散(LiquidLiquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约5l）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。 Garc?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。 4.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion） 4.3.1 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10l蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封（如图3）。 4.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在悬滴法中，如果蛋白质溶液表面张力很小就会在盖玻片表面展开。此时，沉滴法更有利，图4给出了沉滴法的简图。 4.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白质结晶的方法，还有许多透析技术。透析的优点是沉淀溶液容易改变，对于适量的蛋白质溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如图1.5a）。透析膜通过橡皮圈连在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮约10min。对微升量的蛋白质溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛细管（Zeppezauer method）或者树脂玻璃纽扣（如图1.5b）。纽扣的缺点是纽扣中的蛋白质晶体不能通过极化显微镜观察到。 另一中微透析方法在图1.6中有描述，将5l蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的Eppendorf管中。依据分子大小不同的纯化方法1. 透析和超滤透析只用于除盐类和小分子杂质透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） 火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） 其他改型纤维素材料超滤（ultrafiltration） 除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。 为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。2. 密度梯度离心生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。3. 凝胶层析又叫分子筛层析。 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛： 葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）原理： 凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。依据电荷不同的纯化方法1. 电泳概述 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)，也称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳 (disc gel electrophoresis)，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯Ift胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分是分离胶），这二部分凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度,pH以及电场强度都是不同的，即不连续的。这样,电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带（厚度约为0.1 mm），然后再进行电泳分离。PAGE是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。 化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED 光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED 不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。3. 毛细管电泳毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（f2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。 毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、 DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。通过施加10-40kV的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。现在，HPCE已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。人类基因组工程中DNA的分离是用毛细管电泳仪进行的。4. 等电聚焦原理: 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质pH5. 层析聚焦 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。6. 离子交换层析原理基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分1. 平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2. 吸附阶段：样品与反离子进行交换3、 4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用亚基与原体四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基。亚基一般只是一条多肽链，但有的亚基由二条或多条肽链组成，这些多肽链之间以SS相连。四级结构有时还指相同的或不同的球蛋白分子所构成的聚合体。对称的寡聚蛋白质可视为两个或多个不对称的相同结构成分组成，这种相同结构成分称为原体（protomer）。在同多聚体中原体是亚基，但在杂聚体中原体是两种或多种不同的亚基组成。蛋白质变性后的变化由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生变化，导致生物活性丧失及物理化学性质的异常变化，这一过程称为变性（denaturation）。变性涉及次级键的断裂，但不涉及共价键(肽键和二硫键) 的断裂,因而一级结构并未破坏。生物活性的丧失 侧链基团的暴露 物理化学性质的改变: 溶解度.分子形状. 粘度等. 化学性质的改变 变性后的蛋白质肽链松散，内部侧链基团暴露，易于与有关显色试剂接触，使颜色反应增强。生物化学性质的改变:易被蛋白酶水解变性机理温度：温度升高，使分子内振动增强，破坏维系空间结构的次级键的作用（主要是氢键），使蛋白质变性。酸、碱：主要是由于解离基团质子得失后，生成过多正或负电荷，使肽链间静电斥力增加的结果有机溶剂A. 由于有较低的介电常数，常使肽链内静电斥力增加，造成蛋白质分子膨化或松散；B. 在极性较低的有机溶剂环境中，疏水基团易于从内部向外部转移，使疏水作用力削弱，促进蛋白质的变性。重金属盐 在溶液中加入重金属盐类也会影响蛋白质构象的稳定性。重金属盐有可能和蛋白质的极性基团直接作用，使稳定性发生变化，也可能通过改变溶剂的结构间接影响蛋白质的结构。鉴定变性的方法测定蛋白质的比活性测定蛋白质物理化学性质的变化测定蛋白质生物化学性质的变化用免疫法测定蛋白质的抗原性是不是改变蛋白质的溶解度是不是下降。蛋白质组学研究内容蛋白质组学的主要研究内容：1）、蛋白质组表达模式（或蛋白质组组成）的研究，了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类2）、蛋白质组功能模式（目前主要集中于蛋白质的相互作用网络关系）的研究3）、描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与底物结合并且决定其活性的部位研究方法：蛋白质组学研究的策略和趋势：策略包括穷尽法和差异法；研究趋势包括：相互作用蛋白质组学、亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学。分离技术：1）、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳：第一向进行等电聚焦电泳，根据蛋白质的等电点不同对蛋白质进行初步分离。第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照分子量不同对蛋白质进行再次分离。2）、高效液相层析：其第一向根据分子大小分离蛋白质，第二向反向层析（固定相和流动相所有溶剂相反）。鉴定技术：1）、氨基酸组成分析2）、氨基酸序列分析3）、质谱分析4）、翻译后修饰结构与功能的关系（一级结构：细胞色素镰刀型细胞贫血症;高级结构： 血红蛋白Hb的结构与功能Hb由4条肽链组成：2、2，功能是运载O2 。由于血红蛋白亚基之间存在大量离子键，使其构象呈紧张态，对氧的亲和力很低，第一个亚基与O2结合时，离子键的破坏较难，所需要的能量较多。当血红蛋白的一个亚基结合氧之后引起它的构象从紧张态（T）变成松弛态（R），其它的离子键也依次破坏，此时破坏离子键所需要的能量也少，构象的变化导致血红蛋白对氧的亲和力大大增强，因此第四个亚基结合氧的能力比第一个大几百倍。Hb与O2结合后，Hb的构象发生变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能。像血红蛋白这种具有变构效应的蛋白质称为变构蛋白（allosteric protein）。血红蛋白的这种变构效应能更有效地行使其运氧的生物学功能。 在pH相对较低和CO2浓度较高时的外周组织中，随着H和CO2与血红蛋白的结合，其氧亲和力降低，O2被释放到组织中。相反地，在肺部CO2被排除且血液中pH升高，血红蛋白的氧亲和力增加pH和CO2浓度对血红蛋白结合及释放O2的影响称波尔效应。血红蛋白每条肽链的氨基端的-氨基与CO2以氨甲酰基团结合形成氨甲酰血红蛋白，该反应产生的H参与波尔效应。结合的氨甲酰也能形成盐桥，有助于T态的稳定且促进释放O2。O2、H+和CO2与血红蛋白结合部位不同(变构效应): O2结合在血红素的Fe原子上；H+结合在蛋白质某些氨基酸残基上；CO2结合在4个亚基的N末端a-氨基, 形成氨甲酰。Hb四聚体分子只有一个BPG结合部位，位于四聚体中央孔穴内。BPG(甘油酸2,3-二磷酸）结合后，提供了更多的盐键, 通过与两个链形成交联，稳定T态构象，即使平衡由松弛型趋于紧张型，促进O2的释放。在R态时O2的结合引起Hb构象变化，中央孔穴变小, BPG 被挤出。 总之，各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。RNA功能的多样性：1）、控制蛋白质的合成 2）、作用于RNA转录后加工和修饰3）、基因表达与细胞功能的调节4）、生物催化与其他细胞持家功能5）、遗传信息的加工与进化6）、染色体、核糖体、核酸等骨架构成成分7）、信号识别与转导核酸碱基的理化性质：1）、弱碱性2）、紫外吸收特性：260nm3）、嘧啶与嘌呤具有疏水性4）、嘧啶与嘌呤环上的N、酮基和环外的氨基具有亲水性卫星DNA：主要分布在染色体着丝粒部位，由非常短的串联多次重复DNA序列组成，因为它的低复杂性又称简单序列DNA，又因其不同寻常的核苷酸组成，常在浮力密度离心中从整个基因组DNA中分离成一个或多个“卫星”条带，故称卫星DNA。小卫星DNA：一般位于端粒处，由高度重复序列组成的小基因簇。通常有两种形式。微卫星DNA：重复单位序列最短，具高度多态性，在遗传上高度保守，可作为遗传标记。DNA指纹：在人类中VNTRs位点是1.5kb，但人的总DNA提取后用限制线内切酶切成不同的片段，然后以ANTRs中的特异序列为探针进行southern杂交，可发现阳性片段的大小各不相同，由于不同个体的这种串联重复的数目和位置各不相同，所以VNTRs的southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，称其为DNA指纹，可作亲子鉴定。稳定双螺旋结构的力：1）、碱基分子内能2）、氢键3）、离子键4）、碱基堆积力5）、疏水作用增色效应：DNA变性后，它在260nm的吸光值会上升30%以上，这一现象称为增色效应。DNA具有高度弹性的原因：脱氧核糖和磷酸组成的骨架上的键可以自由的移动，随着热力学的变化，可使键弯曲、伸展或碱基分开，这就使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象的这种差异称为多态性。1）、脱氧核糖的五元环能折叠成各种构象2）、组成磷酸脱氧核糖骨架的连续的键可以转动3）、C1-N核糖键可以自由移动DNA构型的生物学意义：1）、沟（特别是大沟）的特征在遗传信息表达过程中起关键作用2）、沟的宽窄及深浅影响调控蛋白对DNA信息的识别，三种构型的DNA处于动态转变之中。3）、DNA二级结构的变化与高级结构的变化是相互关联的。这种变化在DNA复制与转录中具有重要的生物学意义。回文结构：又称为反向重复序列，是一段能自我互补的序列，即同其互补链一样的序列，能形成发卡结构或十字形结构。镜像重复：在同一DNA链上无互补序列，不能形成发卡或十字形结构。测定细胞和组织切片中核酸位置的三种方法：1）、对RNA或DNA具有专一性染色的方法： 孚尔根染色法、荧光染料染色法、碱性染料染色法2）、紫外照相法：260nm下具有强烈的紫外吸收，细胞在此下照相，则含有核酸的结构很容易辨认出来。3）、经专一酶处理后染色稀有修饰组分的意义：DNA分子中的稀有组分常在基因信息的表达调控和保护中起作用。RNA特别是tRNA中也富含稀有成分，在RNA的功能中起作用：tRNA中的许多稀有组分与维持特定的三级结构、密码识别与精确配对有关。与细胞增殖有关与稳定核酸的高级结构及酶的识别有关与细胞癌变有关与基因表达调控有关。单体酶：由一条肽链组成，一般不需要辅助因子。寡聚酶：由两个或两个以上亚基组成的酶。大多是调节酶，多含偶数个亚基。同工酶：指催化化学反应相同，蛋白质分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。酶的比活力：每毫克酶蛋白中所含有的酶活力单位。回收率：每次提纯后酶制剂的比活力/提取液总活力。纯化倍数：每次提纯后酶制剂比活力/提取液比活力。组成酶：是细胞从恒定速率和恒定数量生成的酶类，是细胞中天然存在的，其含量较稳定，一般不受外界条件的影响。诱导酶：是细胞中进入特定的诱导底物后，被诱导生成的，其有无及含量的多少受外界条件的影响。酸碱催化：由质子转移所致的催化作用为酸碱催化作用；由催化剂向反应物提供质子为酸催化，由催化剂从反应物中夺取质子为碱催化。共价催化：在酶催化反应过程中，酶与底物以共价键结合成中间物过滤态以加速反应。即在催化时，亲核催化剂或亲电催化剂能分别放出点子或汲取电子，并作用于底物的缺电子反应中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价键中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。酶的亲核标记：根据酶与底物能特异性结合的性质，设计合成一种含反应基因的底物类似物，作为活性部位的标定试剂，它能像底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基因共价结合，使酶失去活性。Ks型不可逆抑制剂：这类抑制剂主要作用于酶活性部位的必须基团，但也作用于酶非活性部位，取决于抑制剂与酶活性部位必须基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及与非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故称为Ks型不可逆抑制剂。Kcat型不可逆抑制剂：这类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构，而且本身也是酶的底物，可被酶催化而发生类似底物的变化。但这类抑制剂还有一种潜伏性的反应基团，这种基团可因酶的催化而暴露或活化，作用于酶活性中心或辅基，使酶共价共价修饰而失活。酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程，称为酶分子修饰。化学修饰酶：在不引起酶蛋白变性的条件下，某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反应，引起共价结合、氧化、还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变，称为化学试剂修饰。具有这种性质的酶称为化学修饰酶。变构酶与变构调节：变构酶又称别构酶，指酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节称为变构调节，具有变构调节的酶称为变构酶，凡能使酶分子发生别构作用的物质称为别构剂，通常用小分子代谢物或辅因子。过滤态底物类似物：过滤态底物类似物可作为竞争抑制剂。是指底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式，由于能障小，和酶结合后紧密得多，这是酶具有高度催化效率的原因之一。简述酶分离提纯的一般过程及注意事项：因为酶也是蛋白质的一种，其分离提纯过程同蛋白质的分离提纯过程，一般分为：1）、前处理：包括破坏组织，将细胞的亚细胞颗粒碎片与溶液分开，并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来。2）、粗分级分离：采用适当的方法，将需要的蛋白质与其他蛋白质分开。常用方法：盐析法、有机溶剂法、等电沉淀法等。3）、细分级分离：进一步用层析法或电泳对所需蛋白质进行纯化。注意事项：1）、选材：选择酶含量丰富的新鲜生物材料。一种酶含量丰富的组织或器官往往与含量较低的组织或器官相差上千倍或上万倍，目前常用微生物为材料制各种酶制剂。2）、破碎：动物组织较易破碎，一般通过研磨器、匀浆器、高速组织捣碎机即可达到目的，微生物及植物细胞壁较厚，需用超声波、细菌磨、冻融、溶菌酶或用某些化学试剂加以破碎，制成组织匀浆。3）、抽提：在低温下，以H2O或低盐缓冲液，从组织匀浆中提取酶，得到酶的粗提液。4）、分离与纯化：酶是生物活性物质，在分离纯化时必须注意必须尽量降低酶活性损失，操作条件要温和，全部操作一般在05间进行。何谓酶活力：指酶催化某化学反应的能力，其大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。测定酶活力的原理：通过测定酶促反应的初速度来测定酶活力。酶促反应的初速度越大，酶的活力就越强，反之，反应速度越小，酶的活力越若。酶活性的测定方法：1）、测压法：底物或产物之一是气体或酸的，可以用测压计来测定气体体积的变化。2）、分光光度法：底物或产物在紫外光、可见光或红外光区域具有光的吸收。3）、荧光法：4）、电化学法：PH测定法、电位测定、电流测定等5）、旋光测定法：若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性6）、同位素测定法：用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物。温度影响酶活性的机理：1）、温度影响反应体系中的活化分子数，：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。化学反应中温度每增加10度反应速度增加的倍数称为温度系数Q10 。酶促反应的Q10为12 。2）、温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速率下降。PH影响酶活力机理： 1）、PH影响酶和底物的解离。 2）、PH影响酶分子的构象。 过酸或过碱环境可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失；当PH值变化不是太剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响；Ph影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。酶的活性部位、特点、研究其方法、原理：与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心，也称为酶的活性部位。通常包括结合中心和催化中心两部分。特点：1）活性部位在酶分子的总体只占有相当小的部分，催化中心一般由23个残基组成，结合部位的残基数因酶而异。2）酶的活性部位是一个三维实体；可能是一级结构较远而空间结构较近。3）活性中心构象不是固定不变的。4）活性部位位于酶分子表面的疏水性裂缝中，但也含有极性氨基酸，负责结合与催化。5）底物通过次级键结合到酶上。6）酶的活性部位具有柔性或可运动性。研究技术和原理：1）、X射线衍射法：X射线撞击原子中电子后，产生衍射图，分析结构，把纯酶的射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X射线图谱比较，即可确定酶的活性中心。2）、切除法：对于小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关。3）、酶分子上侧链基团的化学修饰：在不引起酶蛋白变性的条件下，某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反应，引起共价结合、氧化、还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变，称为化学试剂修饰。包括非特异性共价修饰和特异性共价修饰。4）、差示标记法：利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团，然后透析出去保护剂，再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中心。5)、动力学分析法：改变PH，通过参数Vmax或Km与PH关系试验，可以提供与反应有关解离基团的pK值，可知哪个氨基酸与酶活性有关。6）、亲和标记：根据酶和底物的特异性结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能像底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。7）、定位诱变法：直接修饰基因片段或个别密码子，有目的的改变氨基酸残基，与野生型酶对比，判断被诱变残基在结合底物、催化底物反应中的作用。使酶具有高效催化效率的因素（酶催化机理）及机制：1）、邻近与定向效应：邻近效应是指酶与底物形成中间复合物后，使底物与底物之间，酶催化基团与底物之间结合于同一分子，使有效浓度大大提高，使反应速率大大加快。定向效应是指反应物的反应基团之间和催化基团与反应基团之间的正确取位产生的效应。邻近、定向效应影响反应速率的原因：1）、酶对底物起轨道向导作用，减少反应所需活化能；2）、酶使分子间反应分子内反应；3）、邻近定向