GB 5521-1989 谷物和谷物产品α-淀粉酶活性的测定 比色法.pdf

中华人民共和国国家标准谷物和谷物产品a - 淀粉酶活性的测定比色法GB 5521一 89Me t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f a l p h a - a my l a s e代替 G B 5 5 2 1 -8 5a c t i v i t y i n c e r e a l a n d c e r e a l p r o d u c t s - Co l o r i me t r i c me t h o d 本标准等效采用国际标准I S O 3 9 8 3 -1 9 7 7 谷物和谷物产品a - 淀粉酶活性的测定比色法 。1 主题内容和适用范围 本标 准规定了 用比色 法测定谷 物和谷 物产 品a 一 淀粉酶活 性所用仪器、 试剂、 分 析步骤和结果计算。 本标准适用于测定谷物和谷物产品a 一 淀粉酶活性，也可用于测定源于真菌或细菌的a - 淀粉酶干粉的活性。2 定义 1 L 溶剂 从1 g 样 品中 所提取的酶， 在规 定条件下， 每秒钟降解1 . 0 2 4 x 1 0 - 5 单位的刀 一 极限糊 精底物溶液，则该样品的a 一 淀粉酶活 性等于一个 单位， 极限糊精是被fi - 淀粉酶完全降解了的 淀粉产物。3 原理 酶降解刀 一 极限糊精底物溶液，应时间的增加而使颜色强度降低， 经过不同 的反 应时间， 将反应混合 物等分加到 碘溶液中。随着反以测定酶活性。4 试剂4 . 1 碘 ( G B 6 7 8 -7 7 ) 14 . 2 碘化钾 ( G B 1 2 7 2 -7 7 ) 14 . 3 冰乙酸 ( G B 6 7 6 -7 8 ) ;4 . 4 硫酸 ( G B 6 2 5 -7 8 ) ,4 . 5 无水乙 酸钠 ( GB 6 9 4 -8 1 ) t4 . 6 抓化钙;4 . 了 可 溶 性 淀 粉 、 注:1 )可采用L i a t n e r 淀粉或质里相当的国产可溶性淀粉。浙江菱湖化工试剂厂产品符合要求。4 . 8 浮石粉，4 . ， 碘贮备液: 称取1 1 . 0 g 碘化 钾溶于少 量水中， 加 入5 . 5 0 9 结晶 碘， 搅拌至碘完全溶解。再定容 至2 5 0 m L，置于棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月;4 . 1 0 碘稀释液: 称取4 0 . 0 9 碘化钾溶于水中，加4 . 0 0 m L 碘贮备液，并稀释至 1 L，用时现配，不可过夜，中华人民共和国商业部1 9 8 8 一 1 2 - 3 1 批准1 9 8 9 一 0 9 ; 一 0 1 实施CB 5 52 1一 .84. 1 14 . 1 24 . 1 34 . 1 4 缓冲液:称取1 6 4 g 无水乙酸钠溶于水中，加人1 2 0 m L冰乙酸用水定容至1 L , 0 . 2 % ( m / 犷 )氛化钙溶液， 0 . 0 5 m o l / L 硫酸溶液; fl - 淀粉酶溶液: 称取l o g 有酶活 性的黄豆 粉 ( 粗细度为通过1 . 5 m m 孔筛 ) ，加 人8 5 rn L 水 和1 5 m L O . 0 5 m o l / L硫酸充分 搅匀， 静置1 5 m i n ，抽滤， 该滤液用于 制备冬 极限糊精底物溶液;4 . 1 5 ,B 一 极限糊精底物溶液: 称取5 . 0 0 g( 于基)可溶性淀粉于小烧杯中，加人约2 0 m L 水混匀， 将其边搅拌边缓慢倒人盛有1 0 0 m L 沸水的5 0 0 m L 高型 烧杯中，并用 洗瓶将 小 烧杯中的 淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2 m i n 。加盖表面皿，在自 来水中冷却至3 0 以下，加入2 5 m L 缓冲溶液及5 0 m L刀 -淀粉酶液，在室温下放置2 0 h ，加人1 勺浮石粉， 将此溶液在1 O m i n 之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5 m i n 以上。冷却至3 0 0C 以下，用水定容至2 5 0 m L , 摇匀， 过滤。滤液中加几滴 甲苯， 此溶液的p H值应为4 . 7 t 0 . 1 ，在2 5 以下可连续使用五天。5 仪器5 . 1 恒温水浴，3 0 士 0 . 1 。5 . 2 恒温水浴，2 0 1 0 . 1 。5 . 3 分光光度计或比色计，石 . 4 秒表.5 . 5 筛 子:孔径为1 . O m m, 1 . 5 m m)5 . 6 p H计。6 . 1分析步骤分光光度计及其空白调整: 将分 光 光 度计连 接 稳压电 源， 预 热2 0 m i n , 调 整波长 为5 7 5 n m 游2 . O m L 抓 化 钙 溶液 加到1 0 . 0 m L稀碘溶液中，然后以 适量的水V , 稀释 ( 加水 量一 般为2 。 一 4 0 m L , V 。 详见6 . 2 ) , 混匀 后达到2 0 C ， 用1 c m比色皿进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。6 . 2 底物溶液的校准: 分别吸取5 . O m L / 3 一 极限糊精溶液和1 5 . 0 m L 抓化钙溶液于一个1 0 0 m L 烧杯中，混匀取出2 . O m L混 合液至另 一个1 0 0 m L 烧杯中，加人1 0 . 0 m L 稀 碘溶液和适量的水， 混匀 置于2 0 水 浴中，用1 c m比色皿在波长5 7 5 n m 处，以6 . 1 所用溶液为参比， 测其吸光度。调整加水最， 使测得的吸光度在0 . 5 5 一0 . 6 0 之间，如果测得吸光度大于0 . 6 0 则增大加水量， 如果测得值少于0 . 5 5 则减少加水量。通过反复试配， 直 至测 定的 吸光 度 值在 。 . 5 5 . 0 . 6 0 之间， 记 下 此时 的加水 最V o ， 并 用 它 调整 空白 溶液的加水量V 。 即为该ft 一 极限糊情测试时的加水量。6 . 8 a 一 淀粉酶的提取: 称取谷物样品约5 g( 精确到0 . 0 5 8 ) ，倒人3 0 0 m L 锥形瓶中，加人预热到3 0 的抓化 钙溶液1 0 0土 。 . 5 m L ，充分 摇匀， 置于3 0 的恒温水浴中。 在1 5 , 3 0 , 4 5 m i n 时从水浴中 取出， 上下颜倒锥形瓶1 0 次，重新置于水浴，共提取6 0 m i n 。取出过滤，滤液即为酶提取液。6 . 4 a 一 淀粉酶活性测定; 把酶提取液和夕 一 极限糊精溶液置于3 0 水浴中，1 0 m i n 后用快速移液管吸移5 . 0 m L井极限糊精溶液至盛有1 5 . O m L 酶提取液的锥形瓶中， 加塞后摇匀。 在加液的同时， 用秒表计时。 吸取1 0 . 0 m L稀碘溶液于 各个5 0 m L 容量瓶中，加人V o m L 水， 混匀加塞后 置于2 0 水浴中， 每 隔5 m i n 或l o m i n进行下列操作:CB 55 21 一 896 . 4 . 1 吸取2 . 0 m L 酶、夕 一 极限糊情混合液到一个盛有 稀碘溶液和h o m L 水的容 量瓶中， 摇匀后置于水浴，使溶液温度达到2 0 1C .5 . 4 . 2 倒人比色皿测其吸光度。了 结果计算7 . 1 计算公式: a 一 淀粉酶活性由下式求得:A = - 5 0 0 x 二、1 0 01 0 0 一hx 1g D , - 1 g D 2t , 一1 , 5 0 0 x f . b 明式中:A - a 一 淀粉 酶活 性，单位， 二 1 0 0 m L 抓化 钙 提取 的试 样质 量 h 试样中水 分含 最，% ， 了 一 酶提取液的稀释倍数， t ， 、t 2 不同的反应时间，m i n , D , , D 2 一 时间t , , t : 时的吸光 度; 1 0 0x 不 n r 不 耳 万， 9争 b -坛 D 对t 的曲 线 的斜 率的绝 对 值，5 0 0 系数。计算举例:含1 4 . 6 % 水分的样品5 . 2 0 g ，用1 0 0 m L 氛化钙溶液提取。由于酶提取液与极限糊精的反应速度太故用抓化钙溶液稀释酶提取液，1 份酶提取液加1 . 5 份抓化钙溶液，1 0 和2 0 m i n 后， 吸光 度分别 为:。因此f = 1 + 1 . 5 = 2 . 5 , fl -，t快极限糊精与酶提取液混合后，间隔5 时间，m i n吸光度D1 g D+ 10 . 4 9 80 . 4 2 50 . 3 0 80 . 6 9 70 . 6 2 90 . 4 8 951020根据5 m i l 湘1 0 m i n 后的观察结果:b 二0 . 6 9 7一0 . 6 2 8 1 0 一 5.见图)。二 0 . 0 1 3 8 mi ri 1用三 个 观察 结 果作坛 D 对r 的 曲 线把6 二 0 . 0 1 3 9 1 代 人公 式 得:A二5 0 0 x 2 . 5 x 0 . 0 1 3 9 15 . 2 0 1 0 0X - , o f不丁 4 . 2= 3 . 9 单位GB 55 21 一 二I g D il吸 光度 D仇仪，1一月.月，.，.闷 b时In l l . m i n7 . a 结果的重复性: 同一 实验室同时或 连续两次测定结果之差， 不得超过平均值的l o a a ，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按下表修约:活性，单位修约成整数范围。单位 G5 0 5 0 -5 0 05 0 0 -5 0 0 05 0 0 0 -5 0 0 0 00 . 1注:测定过 程中 应合理调整酶的浓度， 使3 5 % - 6 0 % 的夕一 极限糊精在1 5 一4 0 m i n 内 降解， 即最后测得的吸光度 为 底物校准时吸光 度的4 0 % - 6 5 0/ a 。 如果吸光 度降得太 快，则酶液可用。 . 2 纬 的抓化 钙溶液再稀释。如 酶 的 活 性太 低 ， 为 获 得正 确 结 果， 可 将 反 应 时 间 延 长 到6 0 m i