M-O真核生物的转录与转录调控.ppt

M 真核生物的转录与转录调控, 真核生物RNA聚合酶,真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较,第一节 真核生物的转录,RNA聚合酶亚基,每种RNA聚合酶均含有12个或更多的不同亚基 每种RNA聚合酶均含有类似于E.Coli core RNA polymerase的亚基，最大的两个亚基彼此相似，并与E.coli RNA聚合酶的和 亚基相似，其他亚基与E.coli 聚合酶中的a亚基具有同源性。 另外还有五种亚基在这三种聚合酶中是共同的，剩下的其他的亚基是各种聚合酶所特有的。,真核生物RNA聚合酶的活性,不需要引物，与细菌聚合酶不同的是与DNA结合时需要辅助因子,RNA聚合酶II的CTD,The largest subunit in RNA polymerase II has a CTD (carboxy-terminal domain) consisting of multiple repeats of a septamer（七聚体）. 羧基末端结构域,Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser Repeat 52 times in the mouse enzyme and 26 times in yeast,重要的磷酸化现象： ser，tyr 磷酸化发生在酶离开启动子的延伸过程,CTD 尾可与 mRNA加工因子发生相互作用，而对mRNA的加工过程产生直接或间接的影响。所以CTD 尾在mRNA转录和加工的偶联过程中发挥了重要作用。,RNA聚合酶I基因：核糖体重复,核糖体RNA基因（成5簇，重复40） 前rRNA转录单元合有编码18S、58S和28S rRNA的三段序列，在基因组中成簇排列，中间被非转录的间隔序列分开。,每一rRNA基因产生一个45S的rRNA转录物，随后被切成28S 、18St)和5.8SrRNA各一个。这种RNA多基因拷贝的连续转录是产生足够量且加工的rRNA、进而包装进核糖体所必需。,核仁的作用 前rRNA由RNA聚合酶I在核仁中合成。rRNA基因排列成环一起组成核仁，也就是熟知的核组织区域。,RNA聚合酶I启动子 前rRNA启动子由两个转录控制区域组成。核心元件和上游调控元件(UCE,核心元件包括转录起始位点，跨越31到6区域。这一序列为转录所必需的。 另一大约50一80个碱基区域称作上游控制元件(UCE)，从起始上游大约100bp处(100)起始。 与核心元件单独作用相比，UCE的存在使转录效率提高了10100倍。,上游结合因子（UBF）与UCE结合，也同时结合到核心元件上游的不同于UCE的位点上，是的两位点间的DNA形成环状结构 UBF缺乏时为低水平转录，存在时转录速率增强,选择因子（SL1）与UBF-DNA复合物结合并使其稳定，然后RNA聚合酶I结合，起始转录 SL1四亚基组成，包括TATA结合蛋白（TBP，为所有RNA聚合酶转录起始所需）和RNA聚合酶I特异的TBP相关因子（TAF）,RNA聚合酶III基因：5S与tRNA基因的转录,RNA聚合酶III 核质中，由16或更多亚基构成，负责转录5S rRNA的前体，tRNA，其他snRNA和胞质RNA tRNA基因 转录控制区位于转录单元内的转录起始位点之后。 有两个高度保守的序列，即A框(5TGGCNNAGTGG3 ) 和B框(5 GGTTCGANNCC3)。 该序列同时也是编码tRNA自身的重要序列，即编码tRNA的D环和TvC环。tRNA内的高度保守序列同时也是高度保守的启动子DNA 序列。,TFIIIC与启动子结合； TFIIIB与TFIIIC-DNA复合体结合； IFIIIB含三个亚基：TBP，BRF和B,负责募集RNA PolIII，起始转录,5S rRNA基因 基因串联成簇， 启动子含有2个保守框：C框位于起始位点下游81-99个碱基处；A框位于起始位点下游50-65个bp TFIIIA结合在启动子C框后，TIIIC与TFIIIA-DNA复合体结合，并与A框结合， TFIIIB结合进来募集聚合酶，起始转录。,可变的RNA聚合酶III启动子，可被上下游序列调控 RNA聚合酶III的终止 在无辅助因子参与下终止，一串A足以终止转录,RNA聚合酶II基因：启动子与增强子,RNA聚合酶II 催化所有编码基因的mRNA前体的合成。RNA聚合酶II转录的前mRNA须经过加帽、加尾和剪接等加工过程,顺式作用元件 定义：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。 例： 启动子、增强子、沉默子等,真核生物启动子的结构,核心启动子（core promoter） 上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）,（1）启动子：在DNA分子中，RNA聚合酶能够识别、结合并导致转录起始的序列。,1、核心启动子 许多RNA聚合酶II启动子都含有一个称做TATA框的序列，该序列位于起始位点上游2530bp处。其他的基因含有一个与起始位点重叠的起始元件，这些元件为基本转录复合体形成和转录起始所需。,定义：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区,作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始,TATA 常在-25bp左右，相当于原核的-10序列 T85A97T93A85A63A83A50,2、上游启动子元件 启动子上游100200bp内的元件通常是有效转录所需的，例如SPl和CCAAT框。,包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等,作用：控制转录起始频率。,CAAT：-70 - -80bp GGGCGG：-80 - -110bp,（2）增强子：指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。,增强子指能从启动子的上游或下游数干个bp处来激活转录的序列元件称为增强子。,增强子特点：, 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍, 增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和靶基因相距3 kb，或在靶基因下游，均表现出增强效应；,An enhancer can activate a promoter from upstream or downstream locations, and its sequence can be inverted relative to the promoter,大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是产生增强效应时所必需的；, 增强效应有严密的组织和细胞特异性，并拥有多种基序。从极长的增强子元件到较短的启动子元件，其内均存在一系列连续的调控元件。, 没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；, 许多增强子还受外部信号的调控， 如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,增强子作用机理：,（3）沉默子：某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。,启动子对转录的影响,原核基因启动区范围较小 TATAAT中心位于710；上游3070区为正调控因子结合序列；120为负调控因子结合序列 真核基因的调控区较大 TATAA/TA区位于-2030;40-110为上游激活区。 原核基因启动子上游只有TTGACA区（3040） 真核基因除了含有可与之相对应的CAAT区之外，许多还有GC区和增强子区,通用转录因子与RNA聚合酶II的起始,RNA聚合酶II的基本转录因子 具有与RNA聚合酶启动子结合并一起起始转录的特征。 以特定顺序在基本启动子组装，受不同水平调控,TFIID 与TATA框结合，由TATA结合蛋白（TBP）与TBP相关因子或多辅助因子构成 TBP 有一个可与TATA的DNA小沟结合的马鞍型结构，可使DNA解旋并引入45o的弯曲，所有RNA聚合酶转录起始所需 TFIIA 可增强TFIID与TATA框的结合，似乎可以终止抑制因子与TFIID的结合 TFIIB 与IFIID结合，为RNA聚合酶和TFIIF加入复合体起桥梁作用 RNA聚合酶进入之后的结合因子 TFIIE，TFIIH和TFIIJ，其中TFIIH可使RNA聚合酶II的羧基末端结构域磷酸化，导致复合体形成。,转录因子 TFIID 转录复合体 TBP TAFs TFIIA TFIIB TFIIF Pol II TFIIE RNA pol 的转录起始, 真核生物转录起始复合物,转录后加工,5端加帽 3端加尾 RNA的剪接 RNA的编辑,真核基因结构,第二节 真核生物的转录调控,反式作用因子,定义：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。,TFD（TATA）、CTF（CAAT）、SP1（GGGCGG）、HSF（热激蛋白启动区）,真核生物的转录因子 与通用转录因子不同，通过与特定启动子结构如增强子的亲和发现，先于特定DNA结合，然后激活转录。,转录因子的类型,1）基本转录因子(Basal factor): 和RNA聚合酶一起结合于起始点和TATA盒； 2）激活剂(activator)： 特异性识别短共有序列元件的转录因子。它们结合于启动子或增强子位点上。通过增加基本转录复合体(basal apparatus)结合于启动子的效率而起作用； 3）辅激活剂(coactivator): 连接了激活剂和基本转录复合体； 4）一些调节因子(Some regulators)： 可使染色质结构改变。,2、结构,DNA结合结构域,转录活化结构域,结构域,连接区,一些转录因子还含有二聚体结构域,（1）DNA结合结构域：,螺旋-转折-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H） 锌指结构（zinc finger） 碱性-亮氨酸拉链（basic - leucine zipper） 碱性-螺旋-环-螺旋（basic helix /loop /helix，bHLH）,同源域是一个DNA结合域，它由60个氨基酸组成，并形成3个螺旋。C端的螺旋有17个氨基酸，它结合DNA大沟。同源域N端臂插入DNA小沟。 含同源域的蛋白质可能是转录的激活剂或阻抑物。,1、螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix）,现广泛分布在从酵母到人类的各种真核生物中，虽彼此在氨基酸的顺序上差别很大，但高级结构高度保守。,Helix 3 of the homeodomain binds in the major groove of DNA, with helices 1 and 2 lying outside the double helix. The N-terminal arm lies in the minor groove, and makes additional contacts.,2、锌指结构,配位键,2-9个,定义：是一种常出现在DNA结合蛋白中的结构基元。是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn构成，形成的结构像手指状。,“锌指”是根据其结构命名的，其中一小段保守氨基酸与Zn2+结合，形成一个相对独立的区域。有两类DNA结合蛋白含有这种结构： 1）经典的“锌指”蛋白质 2）类因醇受体,1）经典的“锌指”蛋白质,典型“锌指蛋白”含有一连串锌指。 单个锌指共有序列如下图所示： Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2- His-X3-His 称为Cys2/His2锌指。,转录因子SP1 （GC盒） 、连续的3个锌指重复结构。,谨慎理解锌指存在的意义： 尤其是蛋白质仅含有单个锌指时，锌指可能参与RNA的结合而不是DNA结合，或它与任何核酸结合活性均无关。,2）类固醇受体,类固醇受体（ Steroid receptors）是配体应答的激活剂,它通过结合类固醇（或其他相关分子）而激活。它们有独立的DNA结合域和配体结合域。 类固醇受体的DNA结合域是一类锌指： Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys 被称为Cys2/ Cys2锌指。 如糖皮质激素受体和雌激素受体各含两个锌指。,配体的结合使得受体（如类固醇受体）能够结合应答元件： 配体结合于受体的C端结构域，提高了DNA结合域对DNA特异靶位点的亲和力。,3、碱性-亮氨酸拉链,二聚体结构域 亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链” 。 肽链氨基端2030个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合。,这类蛋白质的DNA结合结构域实际是以碱性区和亮氨酸拉链结构域整体作为基础的。,这种基序含有4-8个亮氨酸，每两个亮氨酸由6个氨基酸间隔。,4、碱性-螺旋-环-螺旋,DNA结合蛋白有两个共同特征，即存在结合DNA的螺旋区和形成蛋白质二聚体的能力。螺旋-环-螺旋蛋白同时具有这两特征。,除个别情况外，大多数转录因子一旦同DNA结合，便会通过其他因子或RNA聚合酶之间的相互作用，激发靶基因进行转录。这是因转录因子中存在着一种特殊的功能结构域，即常说的转录激活域(Transcriptional activation domain),(2) 反式作用因子中的转录激活域,1酸性激活域,它们之间并不存在较为明显的氨基酸序列的同源性，但却都含有高比例的酸性氨基酸，产生出很强的净负电荷。 例：糖皮质激素受体蛋白质17/82；GCN4为17/60,2 富含谷氨酰胺的激活域 glutamine-rich activation domain,例：在组成型表达的转录因子SP1的两个最强的激活域中，谷氨酰胺几乎占了25%，而带负电菏的氨基酸比例则非常低。,3 富含脯氨酸的激活域 proline-rich activation domain,与CCAAT元件结合的组成型转录因子CTF/NF1，转录激活域位于转录因子的C-末端，含有大量的脯氨酸，约占该区域的1/4。,结构域阻抑物,通过掩盖DNA结合区域或降低转录活性来间接阻断转录因子的活动， 或者本身就含有一个特定的直接阻抑的结构域,转录调控举例1,组成性转录因子：SP1 含有3个锌指结构和2个富含谷氨酰胺转录激活域。,激素调控：类固醇激素受体,转录调控举例2,磷酸化调控：STAT蛋白 干扰素激活JAK激酶，促使STAT 1发生磷酸化， STAT 1二聚化后转移到细胞核中，激活目标蛋白表达,转录调控举例3,第三节 RNA加工与核糖核蛋白复合体,RNA processing and RNPs 发生在转录过程中和转录后，新合成的RNA分子在结构和化学方面的成熟。,细胞内主要含有的RNA： 核糖体RNA (ribosomal RNA, rRNA); 转移RNA (transfer RNA, tRNA) 信使RNA (messenger RNA, mRNA) 核内不均一RNA (heterogeneous nuclear RNA, hnRNA) 真核细胞前体mRNA 核小RNA ( small nuclear RNA, snRNA) 原核生物没有后两种RNA scRNA, small cytoplasmic RNA, 胞内小RNA: several molecules present in the cytoplasm and (sometimes) nucleus,Function of RNA,RNA常见的加工类型： 1 The removal of nucleotides 2 The addition of nucleotides 3 The modification of certain nucleotides,Deletion: 5-leader, 3-tail, intron Addition: 5-cap, 3-poly(A), editing Modification: methylation,rRNA加工与核糖体,rRNA加工与核糖体 rRNA processing and ribosomes RNA加工是对初生转录物进行修饰的总称,原核生物的rRNA加工,大肠杆菌中，rRNA操纵子分散在基因组中，每一操纵子均包含有5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA序列各一个，还包含一到四个tRNA的编码序列。 初生转录物的沉降系数为30S，存在时间很短，经过加工生成rRNA和tRNA分子。RNase酶III、M5、M16和M23等参与了rRNA的加工过程。,转录物通过内部互补序列间的碱基配对折叠形成一些茎环结构，并结合蛋白质称之为核糖核蛋白复合体（RNA-protein complexes，RNPs）。 结合后即开始并完成剪切及修饰，释放出成熟的RNA分子。,真核生物rRNA的加工,真核生物中rRNA100转录单位，由RNA聚合酶I转录生成一个长的单链前体分子包含含有18S、5.8S、28S（后两个构成23S）编码区域的拷贝各一个。5S rRNA由RNA聚合酶III转录，几乎不需要加工。 特定剪切-特异性核糖甲基化（小核糖核蛋白微粒snRNP完成）-折叠-与核糖体复合。 折叠、复合和转录同时在核内进行,Ribosome核糖体,A supramolecular complex of rRNAs and proteins, the site of protein synthesis Have two subunit,真核生物的核糖体,tRNA的加工、RNA酶P和核酶,原核生物的tRNA加工. 大肠杆菌rRNA操纵子包括了tRNA的编码基因区域,此外Ecoli还含有其他多至7种tRNA的基因操纵子, tRNA基因被间隔序列相隔. 成熟的tRNA分子从这些操纵子前体转录物加工.,1.前体转录物折叠形成茎环结构. 2.内切RNase E,F,在3/端切除一个侧翼序列,留下额外的核苷酸. 3.外切RNase D切去3/端7个核苷酸. 4.内切RNaseP内切产生成熟的t.RNA5/端. 5.内切RNaseD切去3/端2个核苷酸., 3/端成熟. 6.tRNA系列硷基修饰.,真核生物tRNA的加工,特点: 5/端带有16 nt的前导区，3/端2个nt及14 nt内合子,1) t.RNA前体形成茎环结构.；2)内切酶的识别切除5/端16 nt和3/端2nt. 3) t.RNA核苷转移酶,在3/端加上, 5/-CCA-3/结构.；4)切除内合子再连接.,真核和原核生物均有发现，为含有一个RNA分子+一个蛋白分子的内切酶，是简单RNP。 作用:修剪前t.RNA分子,产生成熟5/端。 意义：这种RNA是具有催化作用的RNA，称为核酶，即使无蛋白质存在也可催化反应。,核糖核酸酶P和核酶,RnaseP,核酶: 可催化特定反应的RNA分子。细胞内蛋白有助于催化，镁离子可提高活性 RNaseP内切核酸酶；内含子的自我剪接 利用人工设计核酶可体内剪切mRNA分子抑制转录表达，组织病毒复制、杀死癌细胞及基因失活.,mRNA加工:,原核生物m RNA 很少需要加工，m RNA分子边合成边翻译,从5/端开始降解.3/端和5/端可形成茎环结构形成对外切酶的屏障，.在完全降解前,可增加翻译频率 真核生物 mRNA RNA聚合酶转录，前体为核内不均一hnRNA, 加工包括四个方面： 5/端加帽；3/端剪切和加polyA尾； 剪接；甲基化,mRNA加工hnRNP和SnRNP,hnRNP,RNA聚合酶合成的hnRNA很快被蛋白包围,形成核内不均一RNP。 功能 保持hnRNA单链状态，并辅助各种RNA加工反应.,snRNP 颗粒,参与前mRNA的剪接和rRNA 甲基化位点的确定,5端加帽,5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。,在转录进行至2030nt之前，5端强化系修饰，加上一个7-甲基鸟苷残基，称为帽状结构。 通过一个GMP核苷酸的反方向加到新生的RNA转录物上，形成5-5三磷酸桥。由mRNA鸟苷转移酶催化,帽子结构功能： 能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合； m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,3端加尾,多聚腺苷酸尾巴,AAUAAA： 准确切割 加poly（A）,需要DNA和mRNA前体上的特定序列 5-AAUAAA-3 聚腺苷酸化信号序列，其后 11-20nt处紧随一个，5-YA-3结构，Y为嘧啶,下游富含G、U序列-聚腺苷酸化位点 需要聚腺苷酸聚合酶加尾 蛋白因子识别上述序列，组装复合体开始剪切,多聚腺苷酸尾巴功能： 提高了mRNA在细胞质中的稳定性。Poly A结合蛋白结合抵抗3外切酶攻击 有助于细胞之中成熟RNA的翻译,剪接,地中海贫血病人的珠蛋白基因，1/4,切除内含子将外含子连接在一起的过程，发生在核内，mRNA成熟后转录到胞质,剪切识别序列 内含子的5端5-GU-3；3端5-AG-3序列 AG前有一段富含嘧啶的嘧啶区 脊椎动物在嘧啶区上游1040nt处称为分支点序列 5-CURAY-3 也称5-剪切位点,mRNA splicing: Two-step,First, the bond in front of the G at the 5-end of the intron at the so-called 5-splice site is attacked by the 2-hydroxyl group of the A residue of the branchpoint sequence to creat a tailed circular molecule called a lariat and free exon 1. in the second step, cleavage at 3-splice site occurs after the G of the AG, as the two exon sequences are joined togather. The intron is released in the lariat from and is eventually degraded.,mRNA splicing is accomplished through small RNAs (U1, U2, U4, U5 and U6) and associated proteins (snRNPs) which form a complex called the splicesome. First, U1 binds to the 5-splice site and the U2 binds to the branchpoint. The tri-snRNP compex of U4, U5 and U6 can the bind, and in so doing the intron is looped out and the 5- and 3exons are brought into close proximity.,mRNA splicing:snRNP,Molecular Biology,5AGGUAAGU .CURAY(10-40)(U/C)11NCAG G.3,Intron,exon,exon,多聚嘧啶,AG前一位核苷酸影响剪接效率，存在剪接竞争 CAG = UAG AAG GAG,生物体内内含子的主要类型： GU-AG、AU-AC、类内含子、类内含子,可变mRNA加工,可变加工 可将mRNA前体转化为一种以上的成熟mRNA。实现方式： 1可变剪接-特定外显子被剪掉 2可变poly（A）加工-选择不同的poly A位点，产生不同3端的成熟mRNA,可变poly A加工 可变poly (A) 位点： 一些前mRNA含有多于一组的可剪切及加尾序列相同编码区，不同稳定性，或定位的成熟mRNA可在同一细胞中，两个位点，加工并存，也可能一种细胞只利用一种poly A位点，有时可导致采用不同的剪切方式。,2019/7/9,88,可变poly(A) 加工,可变剪切：,四种方式 （1）利用不同的启动子 （2）利用不同的polyA位点使用不同外显子保留的不同 （3）保留内含子，其中含有终止密码子截断的、失活的 （4）外显子的保留或切除，差异，剪切,Patterns of Alternative Splicing,(A) A cassette exon is defined as a regulated exon that is either included in the mRNA or excluded. (B) Alternat