致病菌检验方法((cly).ppt

致病菌检测方法,福建省疾病预防控制中心 陈路瑶,需要检测的致病菌,乙型溶血链球菌 大肠杆菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌 志贺氏菌 沙门氏菌,溶血性链球菌,检测依据：GB/T 4789.11-2003 食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验,检验程序,检 样,葡萄糖肉汤,血平板,血平板（分纯培养）,链激酶试验,杆菌肽敏感试验,观察溶血,革兰氏染色,报 告,361 24h,361,361,24h,24h,1、菌落特征：,溶血性链球菌菌落 特征：灰白色细小 针尖样。菌落周围 形成一个2-4mm宽、 界限分明、完全透 明的无色溶血环。,2、革兰氏染色：,乙型溶血性链球菌 为革兰氏阳性球菌， 在镜下呈现为蓝紫 色，圆形，链状排 列。,3、杆菌肽敏感试验,乙型溶血性链球菌 对杆菌肽敏感，在 涂布了该菌菌液的 血平板上贴上杆菌 肽，36培养18 24h，如果有大于 10mm的抑菌带出 现即为阳性。,4、链激酶试验,乙型溶血性链球菌能产生 链激酶，能激活正常人体 血液中的血浆蛋白酶原， 凝固 形成血浆蛋白酶，而后溶 解纤维蛋白。试验中，能 使凝固的血浆完全溶解为 溶解 链激酶试验阳性。,大肠杆菌,依据：GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准 附录B3 大肠菌群检测方法,1、发酵试验,取样液5ml接种50ml乳糖 胆盐发酵管，置37培养 24h，如不产酸不产气， 则报告为阴性，如产酸产 气，则进行下一步试验。,2、接种平板,乳糖胆盐发酵试验阳性的管， 划线接种伊红美蓝平板。典 型的大肠杆菌菌落为黑紫色 或红紫色，圆形，边缘整齐， 表面光滑湿润，有金属光泽， 也有的呈紫黑色，不带或略 带金属光泽，或粉红色，中 心较深的菌落。,3、革兰氏染色,取疑似菌落作革兰氏 染色镜检，大肠杆菌 为革兰氏阴性杆菌， 镜下呈红色杆状。,5、复发酵,伊红美蓝平板上的 疑似菌落在染色镜 检的同时接种乳糖 发酵管，如有产酸 产气，则可报告检 出大肠杆菌。,绿脓杆菌,依据：GB7918.4-87 化妆品微生物标准检验方法 绿 脓 杆 菌,检验程序：,增 菌 培 养,分 离 培 养,染 色 镜 检,氧化酶试验,绿脓菌素试验,硝酸盐还原产气试验,明胶液化试验,42生长试验,报 告,37培养1824h,37培养1824h,1、增菌培养,如有绿脓杆菌生长， 培养表面多有一层 薄菌膜，培养液常 呈黄绿色或蓝绿色,2、分离培养,绿脓杆菌菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿 润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。,3、染色镜检,取疑似菌落作革兰氏 染色镜检，绿脓杆菌 为革兰氏阴性杆菌， 镜下呈红色短杆状。,4、氧化酶试验,挑取绿脓杆菌可疑菌落 涂在白色滤纸上，加一 滴新配制的1%二甲基对 苯二胺试液，在1530s 内，出现粉红色或紫红 色，为阳性，无色或淡 黄色为阴性。,5、绿脓菌素试验,取可疑菌落接种绿脓菌素鉴 定用培养基，37培养24h, 加入氯仿35 mL，充分振荡 使培养物中的绿脓菌素溶解 于氯仿液中，等氯仿提取液 呈蓝色时，用吸管将氯仿移 到另一试管内并加入1mol/L 的盐酸1 mL，振荡，静置片 刻，如上层盐酸内出现粉红 到紫红色时，为阳性，表示 有绿脓菌素存在。,6、硝酸盐还原产气试验,接种被检纯培养物于 硝酸盐胨水培养基中， 37培养 24h。小倒 管中有气体者，为阳 性，表明该菌能还原 硝酸盐，产生氮气。,7、明胶液化试验,将可疑菌落穿刺接种在明胶 培养基内，37培养24h,取 出放冰箱1030min，如何呈 溶解状态，即为明胶液化试 验阳性，如凝固不溶者为阴 性。,8、42生长试验,挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基 上，放在4142培养箱中24h48h，绿脓 菌能生长，为阳性。不能生长为阴性。,金黄色葡萄球菌,依据：GB7918.5-87 化妆品微生物标准检验方法 金黄色葡萄球菌,检验程序,增 菌,分 离,染色镜检,甘露醇发酵试验,血浆凝固酶试验,报 告,37 1824h,37 2448h,1、增菌：,取样液按1：10比例接 种到SCDLP液体培养基 中，或者可用7.5 %氯 化钠肉汤，置 37培 养箱，培养24h。,2、分离,将增菌培养液划线接种 于血琼脂平板置37培 养2448h，菌落呈金黄 色，大而突起，圆形， 不透明，表面光滑，周 围有溶血圈。,3、染色镜检,挑取可疑菌落涂片 染色镜检，该菌为 革兰氏阳性球菌， 排列成葡萄状，蓝 紫色。,4、甘露醇发酵试验,取上述分纯菌落接种 到甘露醇发酵培养基 中，置 37培养箱， 培养24h。金黄色葡 萄球菌应能发酵甘露 醇产酸。,5、血浆凝固酶试验,玻片法：取清洁干燥载玻片上，一端加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取菌落，分别在生盐及血浆中充分研磨混合。血浆与菌在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象都为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验阴性或盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验。,5、血浆凝固酶试验,试管法：吸取1：4新鲜血浆0.5ml，加入待检菌24h肉汤培养物0.5ml。混匀，于37水浴或恒温箱中，半小时观察一次，24h 内呈现凝块为阳性。,5、血浆凝固酶试验,乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒,志贺氏菌,依据：GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验,检验程序,沙门氏菌,依据：GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验,基本操作步骤,1、前增菌：BPW(缓冲蛋白胨水） 2、增菌： TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液） SC （亚硒酸盐胱氨酸增菌液） 3、分离： BS（亚硫酸铋琼脂） XLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐琼