从活性污泥中培养驯化分离苯酚降解菌的实验研究.doc

精品论文推荐从活性污泥中培养驯化分离苯酚降解菌的实验研究张 慧 河海大学环境学院，南京（210098） e-mail:摘要：苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药、医药合成等行业生产的原料或中间体。随着经济的发展，未经处理的含酚废水对人类的生存环境已经造成了严重的威胁。利用微生物 降解的方法处理含酚废水是一种经济有效且无二次污染的方法。在生物处理过程中，由于含酚废水的难降解特性，因此引入的菌种要有较强的降解苯酚能力，能较好地适应冲击负荷的变化。本文研究的是含苯酚废水的生物处理，即以培养高效菌株为主要研究内容，从吉林省 长春市第一汽车厂的污水处理站的污水、污泥中筛选到几株高效的苯酚降解细菌，能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长。该菌株菌落呈白色，表面光滑。研究采用逐渐提高 苯酚浓度的方法驯化苯酚降解菌，使其对苯酚的降解能力从 300mg/l 提高到 1000mg/l 。从对驯化培养的菌株对苯酚降解率探讨可知，该菌株的生长和对苯酚的降解是基本同步的，而 且由于各菌之间存在协同降解作用，混合菌株对苯酚的降解在各方面都优于纯菌种。关键词：苯酚废水；生物降解；驯化；苯酚降解菌1. 引言随着石油化工、塑料、合成纤维、焦化等工业的迅速发展，各种含酚废水也相应增多， 其中以低温土法炼焦排出的低温炼焦油和其废水中含酚量最多。对焦化厂废水的深入研究已 经证明稀氨水是酚的主要污染源时，其他废水也一定含有相当数量的酚。酚能使蛋白质变性， 高浓度时能使蛋白质沉淀，它对各种细胞都有直接损害作用，对皮肤和粘膜有强烈的腐蚀作 用。长期饮用被酚污染的水，可引起头昏、出疹、骚痒、呕吐、腹泻和精神不安。目前，降解水中酚类物质的方法有吸附法1-3、萃取法4-6、化学氧化法7-9、湿式氧化法 10-13、催化氧化法、光化学氧化法、光化学催化氧化法14-17，但是运用物理和化学处理含酚 废水不仅存在着二次污染，而且不经济，因此本论文研究利用经济有效且无二次污染的微生 物降解的方法来处理含酚废水。从含苯酚的废水中分离筛选对苯酚有降解活性的菌株，并筛 选出降解苯酚效率较好的菌株;采用不断提高苯酚浓度的驯化方法逐渐增强菌株的降解能力; 测定菌株的苯酚降解能力及其生长曲线。2. 苯酚降解菌的分离筛选和驯化2.1 菌种来源活性污泥于 2008 年 3 月 26 日取自长春第一汽车污水处理厂曝气池，取回后放在透明的 容积约 5l 的玻璃瓶中曝气，每天早上停止曝气取出适当的污泥观察 30 分钟沉降比，生物 相，取静置后的上清液测定 ph 值，cod 及挥发酚含量。2.2 实验方法挥发酚：4-氨基安替比林分光光度法 18 酚类化合物于 ph 10.0-10.2 介质中，在铁氰化 钾存在下，与 4-氨基安替比林反应，生成橙红色的叫跺酚安替比林染料，其水溶液在 510mn 波长处有最大吸收。cod：重铬酸钾法ph 值：数字 ph 计- 8 -微生物量的测定方法：比浊法19是在分光光度计或浊度计上进行测定培养液中微生物 的数量。在某一波长的光线，通过混浊的液体后，其光强度将被减弱。入射光与透过光的强 度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。式中:it:透射光的强度;i0:入射光的强度;k:吸光系数;c:样品液的浊度;d:液层厚度;it/i0:透光度 (transmittance) 如果样品液层厚度一定，则 od 值与样品浊度相关，根据此原理，可通过测 定样品中的 od 值来代表培养液中的浊度，即微生物量。菌落生长曲线的测定：721 型分光光度计在 600nm 波长处测定吸光度值。2.3 苯酚降解菌的培养驯化阶段2.3.1 营养的添加采用逐步提高苯酚浓度的方法：在一定容积的 5l 污泥中，苯酚的投加量在不同时间段 的变化为：3 月 28 日到 4 月 4 日 8 天内 1000mg/l 的苯酚的投加量由 100ml 增加到 500ml；4 月 5 日到 8 日 2000mg/l 由 100ml 到 500ml；4 月 9 日到 11 日 3000mg/l 投加量为 400ml；4 月 12 日到 13 日 4000mg/l 由 400ml 到 500ml；4 月 14 日到 5 月 29 日 5000mg/l 由 400ml 到600ml。2.3.2 出水的挥发酚在从 3 月 29 日开始测定挥发酚直到 4 月 29 日的一个月的时间内，挥发酚的吸光度值在0 到 0.007 之间波动。说明我们前一天加入的苯酚在第二天经过了 24 小时的微生物代谢已经 基本被降解了2.3.3 生物相的观察及菌相的变化 每日观察生物相，开始时由于取自曝气池生物相种类多，主要有：累枝虫，漫游虫，钟虫，变形虫，漫游细菌，草履虫，聚缩虫等。在随后的驯化培养期时，主要有：菌胶团，轮虫，累枝虫，还有一些盖虫，壳吸管虫。在中间有时由于一些原因出现污泥膨胀这时生物相 比较单一，主要是：轮虫而且非附着型，丝状菌明显增长。总的来看，生物相比较稳定(如图 1-5)。图 1 变形虫图 2 轮虫图 3 累枝虫图 4 钟虫图 5 菌胶团2.3.4 ph 值的变化我们坚持测定了 54 天的 ph 值。ph1086ph4200 20 40 60图 6 ph 随时间的变化图由图 6 可以看出，ph 值在 5-7 之间波动，波动范围不大，而且一般在 6-7 之间，说明 该类微生物比较适宜于偏中性的环境。2.3.5 代谢产物（cod 的变化）根据 ph 的变化，我们考虑是苯酚的代谢过程中有少量的酸性物质积累，还有微生物的 代谢物含有酸性物质，故根据 cod 在代谢周期（通常为一天）内是否可以降到 30mg/l 以 下，来判断苯酚的降解是否完全。40003500300025002000150010005000010203040系列1图 7 cod 在 30 小时内的降解过程图由图 7 可以看出在最初的两小时内，微生物降解有机物的速率快，能力强，以后降解过 程渐缓，可见有机物并没有被完全降解，故可知在苯酚的代谢产物中仍含有有机物。2.4 苯酚降解菌的分离及生理生化性质2.4.1 固体培养基的分离，纯化1）富集培养基培养基的配制（g/l）：牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，琼脂 20g，nacl5g，定容到 1l 的锥形瓶中。再在 121-126c温度下高温高压灭菌半小时，灭菌后放入苯酚 0.4g（由于苯酚易挥发）。目标菌的接种： 将培养基，培养皿以及接种需要的用具高温高压灭菌后，放在超静工作台上，备用。取沉淀后含有目标菌的上清液进行倍比稀释，分别为：原水上清液，10-1，10-2，10-3 四个倍比。 然后在已灭菌的到入培养基的培养皿上进行平板涂布。培养条件及菌落观察：把接种完毕的培养基倒放入生化培养箱中，在 27c 下恒温培养数天，每天观察菌落的 生长情况。在放入培养箱的第二天四个倍比稀释的培养基中都出现菌落，有黄色和白色两种， 其中白色居多，表面光滑，同时发现菌落下的培养基出现色变反应，变为黑色。2）选择培养基培养基的配制（g/l）：kh2po4 0.4g, mgso4 0.2g, nacl0.2g, nh4cl0.8g,微量 fe，mn，琼脂 20g 定容到1l 的锥型瓶中，再在 121-126c 温度下高温高压灭菌半小时，灭菌后加入苯酚 0.4g（苯 酚易挥发）。目标菌的接种：在选择培养基上我们采用了两种接种方式：将富集培养基上长出的菌落通过划平板接 种在选择培养基上（苯酚的浓度为 400mg/l），分别划平板接种黄色，白色两种。直接将 四个倍比稀释的混合菌上清液平板涂布在选择培养基上。培养条件及菌落观察：把接种的培养基放入恒温生化培养箱中 27c 下培养数天，在经过几天的观察中发现接 种黄色菌落的培养基未有新菌落长出，而接种白色菌落的培养基有菌落长出，说明黄色菌落 非目标菌，即不可降解苯酚。在直接接种的四个倍比稀释的培养基上都长出菌落，其中 10-3 的平板上菌落明显清晰。进一步有以同样的方式再次接种划线，达到三级纯化。图 8 黄色菌落图 9 白色菌落（目标菌）2.4.2 液体培养基的筛选分离1）液体选择培养基培养基的配制（g/l）：kh2po4 0.4g, mgso4 0.2g, nacl0.2g, nh4cl0.8g,微量 fe，mn，定容到 1l 的锥型 瓶中，再在 121-126c 温度下高温高压灭菌半小时，灭菌后加入苯酚 0.4g（苯酚易挥发）。目标菌的接种：取灭菌后的 5 个广口瓶在其中分别到入 100ml 的液体选择培养基，然后分别向每个广 口瓶中加入 5ml（系列 1），10ml（系列 2），20ml（系列 3），30ml（系列 4），50ml（系 列 5）的含混合菌的上清液。培养条件及菌落观察：把这 5 个广口瓶封口放入 30c，120r/min 的恒温摇床振荡，每天（24h）通过在 600nm 波长下测定 od600 值，观察菌落的生长状况，并绘制生长曲线（如图 10）为后期实验研究 做准备。0.450.40.350-0.050 50 100 150 200 250系列1 系列2 系列3 系列4 系列5图 10 不同体积上清液的生长曲线注：纵坐标为吸光度，横坐标为时间，单位以小时计2.4.3 目标菌生长曲线的测定1）测定方法：721 型分光光度计在 600nm 波长处测定吸光度2）目标菌的接种：从固体选择培养基上用接种环选取几个菌落放入液体选择培养基中，编号为 s1（系 列 1），s2（系列 2）；用移液管分别直接移取污泥上清液 1ml（系列 3），3ml（系列4），5ml（系列 5）于液体选择培养基内。3）生长曲线的绘制：0.40.2系列1 系列2 系列3 系列4 系列50020406080100120140160图 11 不同目标菌的生长曲线注：纵坐标为吸光度，横坐标为时间，单位以小时计4）分析：生长曲线反应了微生物的生长状况，分为 4 个期：适应期，对数增长期，减速增长期， 内源代谢期。从图中（横坐标为时间，以小时计；纵坐标为 od 值）我们可以看出在 60-80 小时内，基本都达到了对数增长期，而系列 4 进入对数增长期较晚，而后这 5 个系列基本处 于平稳状态。影响微生物生长的主要参数为能函数，它是有机污染物量与微生物量的比值。 当微生物处于对数增长期时，降解有机污染物的能力强。2.4.4 目标菌对不同浓度的苯酚降解率的测定0.40.2系列1 系列2 系列3 系列4 系列5 系列60-0.201020304050607080图 12 苯酚的降解率曲线注：纵坐标为降解率，横坐标为时间，单位以小时计图中系列 1，3，5 分别是向含不同苯酚浓度培养液中直接移入含有目标菌的上清液 5ml， 可以认为是混合菌；系列 2，4，6 分别是向含不同苯酚浓度培养液中加入固体选择培养基中 的单一菌落。由图可以看出 1，3，5 的降解能力明显高于 2，4，6。从而可知，混合菌由于 协同作用其降解苯酚的能力高于纯菌株。另外，由图可以看到系列 6 几乎对苯酚没有降解， 分析原因可能是：苯酚浓度（1000mg/l）过高，微生物不能适应，或者是培养液中的微生 物由于是菌落在培养液中没有被分散开，影响了降解效果。在图中系列 1，2；3，4；5，6； 分别是对 300 mg/l，500 mg/l，1000 mg/l 的苯酚浓度降解的，从而还可以看出该实验驯化 出的苯酚降解菌比较适合降解低浓度的苯酚，对于高浓度的苯酚还需要进一步的实验研究。3. 结论本论文的研究结论有以下几点：1）从吉林省长春市第一汽车厂污水处理站采集的污水、污泥经过近一个月的驯化培养 及富集培养、多次菌株筛选分离纯化，得到了苯酚降解菌，其形态特征为：白色，表面光滑。 由于实验条件有限未做进一步鉴定。2）本实验采用逐渐提高苯酚浓度的方法驯化目标菌，使其对苯酚的降解能力从 300mg/l提高到 1000mg/l。3）培养基主要成分如碳源、营养成分是影响目标菌生长和降解苯酚的重要影响因子， 另外，目标菌生长同样需要适宜的温度和 ph 。4）从对目标菌对苯酚降解能力探讨可知，目标菌的生长和对苯酚的降解是基本同步的， 而且由于各菌之间存在协同降解作用，混合菌株对苯酚的降解在各方面都优于纯菌株。参考文献1 brasquet c, subrenat e, etal. removal of phenolic compounds from aqueous solution by activated carbon clothsj. water science technology，1999,39(10-11):201-205. 2陈金龙等.树脂吸附法处理高浓度混甲酚生产废水的研究j.南京大学学报，1995,31(4): 598. 3张全兴等.我国应用树脂吸附法处理有机废水的进展j.化工环保，1995, 15 (1):174 江燕斌，钟宇等.炼油碱渣废水处理萃取脱酚实验研究j.化学工程, 2000, 28(5):39-41. 5戴献元，杨义燕，杨雪.络合萃取法处理含酚废水技术j.化工进展，1991,(6): 40-46. 6戴献元，徐丽莲，杨义燕.基于可逆络合反应的萃取技术j.化工进展，1991, (1):30-34.7camel v, bermond a. the use of ozone and associated oxidation processes in drinking water treatment j.water research，1998, 32(11): 3208-3222. 8钟理等.废水中甲苯的臭氧氧化动力学研究j.环境科学研究，2000, 13 (2): 20-22. 9林春绵等.超临界水氧化法降解葡萄糖的研究j.化学反应工程与工艺，2001, 17 (1):79-83.10 modell.m.u.s.patent4, 338, 199, july 6, 1982. 11 modell.m.u.s.patent4, 543, 190, sept24, 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threat on our environment. it is an economic and effective way to treat phenol wastewater with the method of microorganism biodegradation. moreover, the way does not have second pollution. since phenol wastewater has a trait in difficult degradation, bacterium is introduced into the process of organism treatment to degrade phenol and adapt to the changes of impingement load. based on the above problem, biodegradation of phenol wastewater is studied and main study object is to cultivate well-performed strains, which can grow on the cultivating group based on phenol as the sole source of carbon and energy, and these strains were filtered from