低温等离子体对铜绿假单胞杆菌的灭菌实验研究1.doc

精品论文低温等离子体对铜绿假单胞杆菌的灭菌实验研究1高俊玲 1，杨利青 2，陈杰瑢 1，21.西安交通大学能源与动力工程学院，陕西西安（710049）2.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西西安（710049）e-mail: 摘要：目的 初步探讨低温等离子体对铜绿假单胞杆菌的灭杀作用及其灭菌机理。方法 采用rf形式的低温等离子体，对远程等离子体反应装置中的铜绿假单胞杆菌(pseudomonas aeruginosa )标准株atcc15442进行处理，研究其灭菌效果曲线,并利用扫描电镜观察其细胞 壁、膜等外部结构的变化。结果 低温等离子体对铜绿假单胞杆菌有较强的杀灭作用，在反 应室的不同区域杀菌效果不同，且铜绿假单胞杆菌的细菌壁有明显的破损。 结论 低温等离 子体可快速有效地杀灭铜绿假单胞杆菌,在消毒灭菌领域有广阔的应用前景。且基于实验结 果以及实验所用等离子发生器的特殊结构,可知其灭菌效果可能与等离子体反应器中所产生 的活性物种的分布特征和强度有关，其灭菌机制可能与微生物细胞壁、膜的破裂有关。 关键字：低温等离子体；灭菌；铜绿假单胞杆菌；机理中图法分类号： r12；文献标志码： a铜绿假单胞杆菌又称绿脓杆菌，为革兰性阴性菌，是当今条件致病菌的代表菌，当机体 免疫力低下时可引起多种感染。近年来铜绿假单胞杆菌对人的致病作用明显增加,常常引发 一系列严重的化脓性感染，是医院内感染的重要致病菌1。由于铜绿假单胞杆菌具有天然的 和后天获得的耐药性, 对抗生素、消毒剂的耐性较强，因此国际上用传统的灭菌消毒方法对 其灭菌一直没能取得良好的效果，因而本文尝试采用低温等离子体灭菌消毒技术来对铜绿假 单胞杆菌进行灭菌效果及其机理的研究。等离子体消毒灭菌技术的出现被誉为消毒学领域的一大进步，它克服了传统消毒灭菌方 法的一些局限和不足，具有传统方法无法比拟的优点。能够同时具有安全、低温、快速、无 残留毒性，广泛适用的优点，而且能在短时间、多种环境、持续有效、广谱地灭菌 2-4，实 现灭菌技术的“绿色化”，所以又被称为 21 世纪世界环境科学的 4 大关键技术之一。等离子体( plasma)是一种低密度的电离气体云，是游离于固态、液态和气态以外的一种 新的物态体系，也就是物质第 4 态。主要由电子、离子、原子、分子、活性自由基及射线等各种活性物种组成。因其中的正电荷总数和负电荷总数在数值上总是相等的,故称其为等离 子体。等离子体的产生可以说是一个非常复杂的物理和电化学过程，其中包含了电子交换、 电子能量转换、分子碰撞、化学解离 和重组。本文通过低温等离子体对铜绿假单胞杆菌的灭菌实验可知低温等离子体对铜绿假单胞 杆菌有较强的杀灭作用，其灭菌效果可达到 99.9%以上，成功地解决了如何能够即有效又安 全地杀灭铜绿假单胞杆菌这个一直困扰国际医学界的难题。一直以来，低温等离子体灭菌技术的机理研究处于零星、分散的阶段，理论研究十分薄弱，主要原因是等离子体化学的基元反应十分复杂, 气相等离子体活性物种难以分离。杀 菌机理的研究均是针对等离子体活性物种混存状态下实验结果的分析，未见有效分离活性物 种的方法学研究，只是以混存活性物种的表观反应结果为依据作出的推测，各自活性物种对 灭菌的作用和贡献份额不清楚，所以迄今为止尚未能建立起具有普遍说服力的灭菌机理。本1本课题得到国家自然科学基金资助(no.30571636),高等学校博士学科点基金(20060698002),陕西省科技 攻关重点项目(2003k10-g61),西安市科技攻关项目(gg06049)的资助.- 7 -文通过本教研室自行设计的实验装置远程等离子体反应器，通过划分放电区、边缘区和远程区，实现了活性物种有效分离的氛围，解决活性物种有效分离的关键问题，进而也可以 阐明了等离子体中各活性物种对微生物杀灭的作用和贡献份额，揭示等离子体灭菌的机理。1. 灭菌实验1.1实验装置远程等离子体反应器本实验所用的实验装置（本教研室设计）是能使等离子体活性物种有效分离的远程等离 子体反应器。图1为该远程等离子体反应器的结构示意图。等离子体中的电子、离子是具有 电性的高动能、瞬间存在的活性粒子，而自由基是电中性的长寿命气态物质，后者的存活期 比前者长1026倍，依据寿命的差异，可以在下游一定距离处获得电子、离子与自由基分离的 状态，因此获得活性物种有效分离的空间位放电区5、边缘区6和远程区8。在放电区5，活 性粒子（电子、离子、自由基）具有很高的浓度；随距等离子体源距离的增加，电子、离子 的浓度迅速衰减，在距等离子体发生源一定距离处即远程区8获得了较纯的相对高浓度自由 基。图 1 远程等离子体反应装置示意图fig.1 scheme of long-distance plasma reactor1.贮气罐; 2.进气阀门; 3.质量流量计; 4.折流挡板; 5.电感线圈（放电区）; 6.边缘区; 7.试样;8.远程区; 9.热偶真空计; 10.电磁阀; 11.真空泵; 12.接地保护; 13.射频电源; 14.射频匹配网络远程等离子体反应装置的核心是放电系统、真空系统和反应系统。放电系统选择国际研 究主用的射频放电（rf）形式，放电参数在一定范围均可调。真空系统的本底气压可达10-4pa，用于清腔，消除干扰杂质；灭菌气压在10100 pa即可，既可快速又有利于充分发挥等离子体介质（灭菌剂）的杀灭作用。为获得活性物种有效分离的空间位，反应系统设置了具 有放电区5、边缘区6和远程区8的“分区”管式反应段，该管段接近理想管式反应器，能形成 稳流无返混的流场，而反应管段放电区使用折流挡板，利用惯性碰撞的原理，加速高能粒子（电子、离子）的湮灭，强化在远程区8获得自由基反应氛围。也保证活性物种的分离效果。1.2实验菌种和染菌样片载体铜绿假单胞杆菌 atcc15442，购于陕西省微生物研究所，于营养琼脂培养基斜面中培 养。聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate ，pet），别名涤纶树脂，线型聚酯。 外国商品名是 dacron, tetoron, terylene, lavsan。医用高分子材料。1.3放电气体氧气，氩气，空气（78%氮气，22%氧气混合气体），纯度均为 99.9%。1.4细菌悬液的制备将铜绿假单胞杆菌atcc15442作增菌培养6-8，再用接种环取增菌培养物划线接种于营 养琼脂培养基平板。挑取典型单菌落,接种斜面37 培养过夜。然后用5 ml无菌移液枪吸取5 ml pbs（已灭菌）加入到斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。将菌悬液移至另一无菌试管 中，保存在4 冰箱内备用，当天制备当天使用。1.5菌涂片的制备将大小为 25 mm 50 mmpet 薄膜，依次放入丙酮和乙醇及二次蒸馏水中分别超声洗涤10 min 以除去表面的油污及杂质，然后自然晾干，用牛皮纸包装好后经压力蒸汽灭菌（0.1mpa，20 min）后备用。吸取 10 l 上述菌悬液均匀涂布于处理过的 pet 薄膜上，于 37 恒 温箱内干燥。1.6等离子体处理在远程等离子体场中，为了获得活性物种有效分离的空间位，将反应室分为三个不同的 区域即放电区(040 cm)、边缘区(4060 cm)和远程区(6080 cm)，并将菌涂片分别置于 0 cm，15 cm，30 cm，45 cm，55 cm，60 cm 和 75 cm 七个不同的位置，进行不同时间 10 s，15 s，30 s，60 s，90 s 和 120 s 下的处理。具体技术参数:氧气（o2），作用功率（p）35 w， 气体流量（q）20 cm3/min；氩气(ar)，作用功率（p）15 w，气体流量（q）20 cm3/min； 空气，作用功率（p）60 w，气体流量（q）30 cm3/min。1.7活菌培养计数将等离子体处理后的涂有铜绿假单胞杆菌的pet薄膜放入含有10 ml pbs 溶液的试管 中，超声波振荡10 min后将菌洗下成为菌悬液，将该菌悬液进行系列稀释,选择适宜稀释度吸 取0.1 ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种3 个平皿。采用涂布法，于37 恒温培养24 h， 进行活菌计数。1.8灭菌效果测试等离子体各处理参数对铜绿假单胞杆菌的杀菌作用指标采用杀菌效果（germicidaleffect，简称 ge）来表征，按下式计算ge = log n0 log nt式中，n0 为实验前或阳性对照组样品生长菌落数(cfu)；nt 为实验组生长菌落数(cfu)。在 前面的灭菌效果实验中，记录的平皿菌落数需乘以稀释倍数，换算成每毫升活菌数，按 菌落数适宜（30300 个/板）的同一稀释度求取 23 个平板间的菌落平均值，并对平行 实验中的两组数据取平均值方能带入上式。此外，要求阴性对照组无菌生长，用此来证 明所用试液和培养基无污染，否则实验结论需重新验证。2. 结果与讨论2.1等离子体对铜绿假单胞杆菌的灭菌效果等离子体对铜绿假单胞杆菌有较强的杀灭作用。从图24可看出不同的气体等离子体对 铜绿假单胞杆菌有着不同的杀灭作用，其中氧气的效果最好，空气次之，氩气较差。但它们 有着相似的变化趋势，都是随着时间的增长，铜绿假单胞杆菌的去除效果越好。在放电区处，气体等离子体对铜绿假单胞杆菌的灭菌率最好，可达到99.9%以上。这主 要是因为在放电区的各种活性粒子浓度都很高，因此对铜绿假单胞杆菌的刻蚀作用也很大。 通过刻蚀，这些高能粒子的击穿作用及高能自由基团的氧化作用使得铜绿假单胞杆菌被逐个 原子地侵蚀，导致铜绿假单胞杆菌结构破损以及生命物质的变性凝固而达到灭菌效果。同时 此处紫外线强度也较大，刻蚀机理因紫外光子作用而增强从而加速了铜绿假单胞杆菌的杀 灭，造成铜绿假单胞杆菌的大部分死亡。而在远程区，虽然它的灭菌效果比之其它区域较差， 但是也直接反映了活性自由基通过原子反应对铜绿假单胞杆菌的侵蚀作用，说明了活性自 由基对杀灭铜绿假单胞杆菌的贡献份额。在处理时间为90 s时，氧气等离子体对铜绿假单胞杆菌的灭菌效果可达3.02，空气和氩 气对铜绿假单胞杆菌的灭菌效果也可分别达到2.82和2.56。从90 s之后，灭菌效果趋于稳定， 主要是因为在90 s时间内几乎所有的物理化学反应已完成，大部分的铜绿假单胞杆菌已被杀 灭。3.13.02.9放电区 边缘区 远程区2.8灭菌效果/ge2.10 20 40 60 80 100120处理时间/s图2 氧气等离子体对铜绿假单胞杆菌的杀灭效果图fig.2 sterilization effect of p. aeruginosa by oxygen plasma2.22.0灭菌效果/ge1.21.00.80.6放电区 边缘区 远程区0 20 40 60 80 100 120处理时间/s图3 氩气等离子体对铜绿假单胞杆菌的杀灭效果图fig.3 sterilization effect of p. aeruginosa by argon plasma放电区 边缘区 远程区3.02.62.5灭菌效果/ge2.12.01.6020406080100120处理时间/s图 4 空气离子体对铜绿假单胞杆菌的杀灭效果图fig.4 sterilization effect of p. aeruginosa by air plasma2.2扫描电镜分析图5为空气等离子体处理前后铜绿假单胞杆菌的扫描电镜图。通过扫描电镜观察发现铜 绿假单胞杆菌细胞壁在等离子体作用下结构发生改变，铜绿假单胞杆菌的细胞壁、膜在等离 子体的处理下明显破裂。（a）为铜绿假单胞杆菌的完整形态图，（b）、（c）、（d）分别 为空气等离子体在放电区、边缘区和远程区处理90 s的菌体形态图。从图中我们可以看出， 在放电区的铜绿假单胞杆菌细胞壁破裂最厉害，边缘区次之，远程区的细胞破裂程度比较差。 主要原因是在放电区来自于等离子体中的各种活性粒子（电子、离子、自由基）浓度比较高， 对铜绿假单胞杆菌细胞的刻蚀作用比较大，进而造成的细胞壁破裂最厉害；而在远程区只有 自由基作用于细胞，所以对细胞壁的破裂作用相对也比较微弱。abcd图5 空气低温等离子体处理前后铜绿假单胞杆菌的扫描电镜照片（10 000）（a）原菌,（b）、（c）、（d）分别为放电区、边缘区和远程区处理90 s的菌体形态3. 结论通过铜绿假单胞杆菌的灭菌效果实验可知，低温等离子体可快速有效地杀灭铜绿假单胞 杆菌。且基于实验结果以及实验所用等离子发生器的特殊结构,可知其灭菌效果可能与等离 子体反应器中所产生的活性物种的分布特征和强度有关， 在各种活性粒子（电子、离子、 自由基）存在且浓度较高的放电区，杀灭效果较好，这将在消毒灭菌领域有广阔的应用前景 通过扫描电镜结果可知，铜绿假单胞杆菌细胞壁的破灭验证了前人所说的革兰氏阴性菌 的胞膜破裂说，微生物细胞壁、膜的破裂可能为其灭菌机制。而且本文发现由于放电区、边 缘区和远程区这三个区域活性物种的分布特征和强度不同，对细胞膜的破坏程度也不同，所以我们从扫描电镜图可看出在这三个区域铜绿假单胞杆菌细胞壁、膜的破裂程度也不一样。 铜绿假单胞杆菌广泛分布于自然界,尤其是医院内环境之中。是医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表,也是预防医院内感染的重点监控菌种。等离子体快速、安全、绿色的消毒灭菌技术受到越来越多人的关注，它对铜绿假单胞杆菌的灭菌效果和灭菌机理也将会受到 越来越多人的关注和探讨。4. 致 谢本文是在我的导师陈杰瑢教授和杨利青师姐的亲切关怀和悉心指导下完成的。衷心感谢 她们的教诲、关怀、支持和帮助，她们严谨求实、一丝不苟的科学态度，敏锐的思辨能力和 在学术上的远见卓识，给我留下了难以磨灭的印象。在写此文和修改期间，给予我无私的帮 助，提出了宝贵的意见。论文的完成凝聚着她们极大的心血和辛勤的劳动。在此，仅对导师 和师姐高尚的品德、严谨的治学态度和卓识的学识水平表示诚挚的敬意，对她们孜孜不倦的 教诲表示衷心的感谢！在本文完成期间，亦得到教研室其他各位老师、各位同学的热情帮助和鼎力支持。在此 还特别感谢：国家自然科学基金(30571636)，高等学校博士学科点专项科研基金(20060698002)，陕西 省重点科技攻关项目(2003k10-g61)和西安市科技攻关项（jg6049）的资助。参考文献1 philippon a., arlet g., jacoby g.a. plasmid-determined ampc-type -lactmamsesj. antimicrobial agents&chemotherapy, 2002,46 (1):1-11.2 m g kong. a complementary sterilisation strategy using cold atmospheric plasmasj. medical devicetechnology, 2006, 17(3): 26-28.3 tamer akan, naci ekem, yurdanur akgun, abdurrahman kiremitci, ahmet cabuk, suat pat, geavit musa. plasma sterilization using the high voltage pulsed discharge at atmospheric pressurej. jlurnal of applied sciences,2006, 6(7): 1566-1570.4 ray taurasi. what exactly is gas plasmaj. healthcare purchasing news, 2003, 27(5): 44. 5 陈杰瑢.低温等离子体化学及其应用m.北京:科学出版社, 2004: 1-10.6 钱存柔,黄仪秀.微生物学实验教程m.北京:北京大学出版社, 1999: 245-276. 7 张文福.医学消毒学m.北京:军事医学科学出版社, 2002: 283-299.8 黄秀梨.微生物学实验指导m.北京:高等教育出版社, 1999: 199-210.sterilization experimental study of non-thermal plasma onpseudomonas aeruginosagao jun-ling1, yang li-qing2, chen jie-rong1,21.school of energy and power engineering, xian jiaotong university, xian （710049）2. school of life science and technology, xian jiaotong university, xian (710049)abstractobjectiveto investigate preliminarily the sterilizing effect of non-thermal plasma onpseudomonas aeruginosa and further exploit the possible mechanism. methods p. aeruginosa atcc15442 were treated by rf non-thermal plasma in long-distance plasma reactor, their sterilizing effect curve was analyzed and the morphological changes of bacterial cell membrane and wall were studied by scanning electron microscope (sem). resultsnon-thermal plasma hadstron