大豆多肽复合酶解工艺条件研究.pdf

良 品 技 J I 【 食品科技 $ C 1 EANO董 目 擗删L o 6r 大豆多肽复合酶解工艺条件研究 周利亘 。陈新峰 ，王君虹 ，袁亚 ，陈坚 ，谢磊 ，管延金 ( 1 浙江省农业科学院食品加工研究所，杭州 I 3 1 0 0 2 1 ； 2 杭州市豆奶食品厂，杭 州 3 1 0 0 1 6 ) 摘要 ：以大豆分 离蛋 白为原料 经蛋 白酶 酶解、分 离、提 纯可以制得 大豆多肽。试验采 用复合酶解法 结合 正交试验分析 确定 大豆蛋 白复合 酶解 的最佳工 艺条件 为 ：三酶复合蛋 白酶( 由中性蛋 白酶 、木 瓜蛋 白酶和 菠萝蛋 白酶 以1 ： 2 ： Z 的比例复合而成) 、底 物浓度4 、p H 7 0 、酶解 时间9 h 、大豆蛋 白酶水解 度( D H ) 8 4 4 0 。 关键词 ：大豆 多肽 ；酶解 ：正 交试验 中图分类号 ：T S 2 0 I 2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1 0 0 5 9 9 8 9 ( 2 0 0 5 ) 0 7 0 0 2 2 0 4 St u d y o n t h e t e c h n o l o g y c o n d i t io n s o f s o y p e p t i d e s b y c o mp o s it e e n z y ma t ic h y d r o ly s i s Z HOU L i - g e n ， CH E N X i n - f e n g ， WAN G J u n - h o n g ， YU AN Y a ， C HE N J i a n 2 , X I E L e i ， GUA N Y a n - j i n ( 1 I n s t i t u t e o f F o o d P r o c e s s i n g ， Z h e j i a n g A c a d e my o f A g r i c u lt u r e S c i e n c e s ， H a n g z h o u 3 1 0 0 2 1 ： 2 H a n g z h o u S o y b e a n Mi l k F o o d F a c t o r y ， Ha n g z h o u 3 1 0 0 1 6 ) Ab s t r a c t ：Th e s o y p e p t i d e s wer e ma d e f r O m s o y p r o t e i n is o l a t e s b y e n z y ma t i c h y d r o ly s is I n t h i s r e s e a r c h t h e b e s t t e c h n o l o g y c o n dit i o n o f en z y ma t i c h y d r o l y s i s wa s d e t e r mi n e d b y o r t h o g o n a l t e s t Th e r e s u l t s h o we d t h a t t h e b e s t t e c h n o l o g y c o n dit i o n wa s t h a t t h e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n wa s 4 t h e c o mp o s it e e n z y me s we r e ma d e u p o f n e u t r a l p r o t e in a s e ， p a p a i n an d b r o me l a i n wi t h t h e p r op o r t io n o f 1 ： 2 ： Z，p H= 7 0 ，t h e h y d r o l y s i s t i me wa s 9 h Th e DH wa s 8 4 4 0 Ke y wo r d s ：s o y p e p t i d e s ； e n z y ma t i c h y d r oly s i s ； o r t h o g o n a l t e s t 0 前言 大豆多肽是大豆蛋 白经过酶解 、分离 、脱 色 、脱 盐、超滤 、浓缩 、喷雾干燥等工艺精制而得的多肽混 合物，主要以3 6 个氨基酸组成的小分子肽为主，还 含有少量大分子肽 、游离氨基酸等成分 。大豆多肽 的肽含量为8 0 ，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同 必需氨基酸平衡 良好 ，且含量丰富。与传统大豆蛋 白相 比，大豆多肽具有高浓度 、高溶解性 、低黏度、 高流动性和热稳定性等优良的物理性质。另一方面， 大豆多肽具有独特的生理功能 ：吸收快 、利用率高、 能促进脂肪代谢 、降血压 、降血清胆固醇、增强肌肉 运动力 、增强免疫 功能 、消除氧 自由基 、防治糖尿病 和老年性痴呆 、预防骨质疏松等【 l 】。 收稿 日期 ：2 0 0 4 1 2 2 0 基金项 目：浙江省科技厅科技 计划项 目( 2 0 0 3 C 3 2 0 2 2 ) 。 作者简介 ：N I $ )l - ( 1 9 6 6 - ) ，男，浙江绍兴人 ，主要从事食 品、乳品深加 工的研 究工作。 维普资讯 霞品燃 萱 睁 蚤 礴 睦 鞫 翻 啭 蔫 肆蘸 蕈 El 嘲 I 口6 y 作为一种新型的功能活性因子 ，大豆多肽在营 养疗效食品、功能食品、保健食品、婴儿食品、发酵 食品和强化运动饮料中有广泛的应用价值 ，潜藏着 广阔的市场前景和巨大的社会经济效益。大豆多肽 的开发成功将会对大豆深加工产生重大影响，也为 人类的健康提供优良的新食物资源。 本试验 以大豆蛋 白为原 料 。以酶水解 度为指标 。 采用正 交试 验对 大豆 多肽 复合 酶解 工艺 条件 进行 试 验 比较 。通 过分析 。得 到最佳复合酶组合和最佳酶解 工艺条件。 1 材 料与方法 1 1 材料 、试剂及仪器 大豆分离蛋白：黑龙江三江食品公司；菠萝蛋白 酶：广西南宁庞博生物科技有限公司：酸性蛋白酶 、 中性蛋 白酶 、木瓜 蛋 白酶 ：上海宝丰生化有限公司 ： 氢氧化钠、浓硫酸、盐酸 、硼酸、活性炭 ：A R； 消化催化剂 ；阴 、阳离子交换树脂 ； 恒 温 水 浴锅 ：江 苏 常熟 医疗 器 械 厂 ：B S 2 0 0 S WE 1 电子天平 ：北京塞多利斯仪器有限公司；8 0 0 型 离心沉淀器：上海手术器械厂：R l O 0 2 B 真空旋转蒸 发器：上海申生科技有限公司；试验喷雾干燥器：江 苏常州干燥设备厂。 1 2 方法 1 2 1 大豆蛋白酶解液中总氮的测定取大豆蛋白酶 溶解液5 m L ， O Al g 消化催化剂和l O m L 浓硫酸，在高 温下消化至黄绿色，取出冷却至室温加水定容。然 后取5 m L J J I 入到扩散皿 的外 室 ，并在扩 散皿 的 内室加 入2 m L 硼酸溶液 ，向外 室中加 入4 mL 浓N a O H 溶液 并 迅速盖上 盖片 。在 自然环境下 放置2 4 h 后 用标 准的 盐酸溶液滴定硼酸溶液至紫罗兰色即可。 总氮( N = 1 0 0 式中：V ，空白滴定耗用标准酸溶液体积， m L ： V 厂滴定待测液耗用标准酸体积，mL ： N 标 准酸当量浓度 ： 稀释倍数制备液体积 吸取体积， 倍； 0 0 1 4 1 mL 当量氮的克数 ，g 。 1 2 2 酶水解度D H的测定 T c A 法2 1 在 l O mL 酶解 液中加入l O m L 2 0 T C A 溶液，混合振荡 ，4 0 0 0 r mi n 离心1 5 mi n ，取上清液。溶液总氮和上清液可溶性氮 由1 2 1 中的方法测定。 酶水解度( D H ) ( ) = 3二 x 1 0 0 式中 ：N 。_反应前大豆蛋 白溶液中r ic o T C A 可溶 艮 品 技 性 氮 ： N 大豆蛋 白溶液 中总氮 ； N 大豆蛋 白酶解 液中 1 0 T C A 可溶性 氮 。 1 3 大豆 多肽工 艺流程 及工艺要点 大豆蛋 白溶 液一 预 处理一 复合 酶 解一 灭酶 一 离 心 分 离一 脱苦 脱 色一 树 脂脱 盐一 超 滤一 真 空浓缩一 喷 雾干燥一 大豆多肽 1 3 1 预处理大豆蛋白溶液迅速升温到8 5 ( 2 并保持 恒温 1 5 m i n rl 。 1 3 2 复合酶解在 大豆蛋 白溶液 中添加不 同种类 的 复合蛋 白酶 ，并 在一定 的p H、时 间 、底 物浓度 条件 下进行 酶解处理 。 1 3 3 灭酶酶解液迅速升温到9 0 并保持2 0 m i n 。 1 3 4 离心分离4 0 0 0 r mi n 离心1 5 mi n 1 3 5 脱苦 、脱色 在一定的温度、时间和p H 条件下 加入定量的粉末活性炭处理 1 3 6 树脂脱盐脱苦 、脱色后的大豆多肽溶液以一 定 流速 分别 流经阴 、阳离子交换树脂 。 1 3 7 超滤( 纳滤) 截 留分子量M2 0 0 0 超滤( 纳滤) ，进 一 步纯化 大豆多肽。 1 3 8 真空浓缩在一定的温度和真空度条件下将大 豆多肽溶液浓缩到原溶液体积的2 0 。 1 3 9 喷雾干燥在一定 的温度条 件下将 大豆多肽浓 缩液进行喷雾干燥。 2 结 果与分析 2 1 单酶水解 根据蛋 白酶及大豆蛋 白酶解工艺的特性 经过 初步筛选 ，得到较为理想的几种蛋白酶 ：中性蛋 白 酶 、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和酸性蛋 白酶等。通 过单酶水解试验 ，分析比较各种蛋白酶对大豆蛋 白 的酶水解度 ，结果见 图1 。 5 0 4 0 誊 3 0 2 0 1 0 0 厂 木瓜 酸性 中性 菠萝 蛋白酶 蛋白酶 蛋 白酶 蛋白酶 蛋白酶 图I 不 同蛋 白酶对水解度的影响 试验结果表明：酸性蛋白酶的水解度最小，其主 要原 因是 酸性 蛋 白酶 的最佳 酶解 p H 在 大豆 蛋 白等电 点 以下 ，容易引起蛋 白质 的变性 ，从 而影响大豆蛋白 维普资讯 目 品 技 市_ 水 解度 。故本 试验 选 用 中性 蛋 白酶 、木 瓜 蛋 白酶 、 菠萝蛋白酶作为大豆蛋白水解酶 ，并展开进一步 的 试验研究 。 2 2 多酶复合水解 将 中性 蛋 白酶 、木瓜 蛋 白酶 、菠萝蛋 白酶复 配 ， 组合得到4 类复合酶 分别定义为E a 类 、E b 类 、E c 类 、E d 类( E a ：木 瓜蛋 白酶 和 菠萝 蛋 白酶复合 ；E b ： 中性 蛋 白酶 和木 瓜蛋 白酶 复合 ；E c ：中性 蛋 白酶 和 菠 萝蛋 白酶 复合 ；E d ：中性蛋 白酶 、木 瓜 蛋 白酶 和 菠萝蛋 白酶三酶复合) 。 通过对4 类复合酶的正交试验分析 从中筛选出 最佳复合蛋白酶组合和最佳酶解工艺条件。 2 2 1 双酶复合 法( E a ：木瓜 蛋 白酶与 菠萝蛋 白酶) 酶 解 大豆蛋 白的最 佳工 艺条件影响 大豆 蛋 白水解 度 的因素很多，经过初步实验筛选 ，确定以2 种酶( 木瓜 蛋白酶与菠萝蛋白酶) 的比例、p H值、底物浓度 、酶 解时间为试验因素 ，每个因素选3 个水平 ，以水解度 为指 标 ，采 用L 4 3 ) 的正 交表进 行正 交试 验 结果 见 表 1 表 1 E a ：木瓜与菠萝蛋 白酶复合水解 大豆蛋 白 正交试验结果 通过表1 比较4 个因素的极差 各因素对酶水解 度影 响大 小为底物浓 度 蛋 白酶 比例 酶 解时 间 p H E a 双 酶 复 合 酶 解 大 豆 蛋 白 的 最 佳 工 艺 条 件 是 c 。 A 。 D 3 B 。 ，即底物浓度 为4 、木瓜 蛋 白酶与菠萝蛋 白 酶 比例为 l ： l 、酶解 时间为9 h 、p H 为6 5 。 2 2 2 双酶复合 法( E b ：中性蛋 白酶和木瓜 蛋 白酶) 酶 解大豆蛋 白的最佳 工艺 条件以2 种酶 ( 中性 蛋 白酶和 木瓜蛋白酶) 的比例 、p H 值 、底物浓度 、酶解时间为 试验因素，每个因素选3 个水平 ，以水解度为指标 采用 3 4 ) 的正交表进行正交试验，结果见表2 。 表2 E b ：中性和木瓜蛋 白酶复合水解 大豆蛋 白的 正 交试验结果 通过表2 1 ： L 较4 个因素的极差 ，各因素对酶水解度 影响大小为蛋白酶比例 p H 酶解时间 底物浓度 。E b 双酶复合酶解大豆蛋 白的最佳工艺条件是A 1 B ， D ， C ， 即 中性蛋 白酶与木瓜蛋 白酶 比例为 3 ： 1 、p H为7 5 、酶 解时 间为9 h 、底物浓度为4 。 2 2 3 双酶复合法( E c ：中性蛋白酶和菠萝蛋白酶) 酶 解大豆蛋 白的最佳工艺条件以2 种 酶( 中性蛋 白酶 和 菠萝蛋 白酶) 的 比例 、p H、底 物浓度 、酶解 时间为试 验因素 ，每个因素选3 个水平 ，以水解度为指标。采 用 3 4 ) 的正交表进行正交试验，结果见表3 。 表3 E c ：中性和菠萝蛋 白酶复合水解大豆蛋 白的 正交试验结果 通过表3 比较4 个 因素的极差 ，各因素对酶水解 维普资讯 窝 鞫 攘 度影响大小为p H 酶解时间 底物浓度 蛋白酶比例， E c 双 酶 复 合 酶 解 大 豆 蛋 白 的最 佳 工 艺 条 件 是 B D 3 C 。 A 。 ，即p H为7 0 、酶解时 间9 h 、底物浓度 为4 、 中性蛋白酶与菠萝蛋白酶比例为3 ： 1 。 2 2 4 三酶复合法( E d ：中性蛋白酶 、木瓜蛋白酶和 菠萝蛋白酶) 酶解大豆蛋白的最佳工艺条件以3 种酶 f 中性蛋 白酶 、木瓜蛋 白酶和菠萝蛋白酶) 的 比例 、 p H、底物浓度 、酶解时间为试验因素 ，每个因素选 3 个水平 ，以水解度为指标 ，采用 3 4 ) 的正交表进行 正交试验 ，结果见表4 。 表4 E d ：中性蛋 白酶、木瓜蛋 白酶和 菠萝蛋 白酶复合水解大豆蛋 白正交试验结 果 通过表4 比较4 个因素的极差 ，各因素对酶水解 度影响大小 为底物 浓度 p H 酶解 时间 蛋 白酶 比例 ， E d 三 酶 复 合 酶 解 大 豆 蛋 白 的最 佳 工 艺 条 件 是 c 。 B 2 D 。 ，即底物浓度为4 、p H 为7 0 、酶解 时间9 h 、 中性蛋白酶 、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的比例为l ：2 ： Z 。 2 2 5 最佳工艺条件下4 类复合酶水解度结果比较4 类复合酶分别在其最佳工艺条件下水解大豆蛋 白 测定其水解度 ，经分析 比较 ，得出最佳复合蛋 白酶 组合 ：三酶复合法水解大豆蛋 白其水解度最高 最 佳工艺条件为 ：中性蛋白酶 、木瓜蛋 白酶和菠萝蛋 白酶按l ： 2 ： Z 比例复合、底物浓度4 、p H为7 0 、酶解 时间9 h ，酶水 解度D H 达 到8 4 4 0 。 2 3 大豆 多肽溶液的脱苦 、脱 色工艺 大豆蛋白分子含有一定的疏水性基团，经酶解 后 会生 成部分 疏水 性 多肽 ，而疏 水性 多 肽是 产生 苦 味的主要原因。多肽溶液苦味的出现与大豆蛋白的 水解程度有一定的关系，只有在分子量小于6 0 0 0 时， 才出现苦味 ；随着水解度的提高 ，疏水性氨基酸暴 露越多，苦味就越明显；但是当水解度进一步提高 曩 品 技 水 时 苦味肽 继续 被水 解成 分 子量 更小 的短 肽或 氨基 酸 此时苦味减弱甚至消失 I 。另外 ，由于酶本身 的颜色和酶化学反应使得酶解后的多肽溶液呈黄褐 色 影响大豆多肽成品的色泽。试验采用三酶复合 法提高大豆蛋白水解度 ，结合2 粉末活性炭吸附处 理达到了理想的脱苦 、脱色效果。 2 4 大豆多肽溶液的脱盐工艺 在酶解过程 中，为提高大豆蛋 白水解度 ，须添 加氢氧化钠调节大豆蛋白溶液的p H，使其达到酶的 最适p H 值 ；另一方面 ，酶解结束后 ，须添加盐酸溶 液沉淀未被酶解的大豆蛋白，以分离提取大豆多肽 成分。在最终的多肽溶液中含有一定浓度的氯化钠 ， 因此必须经过脱盐处理 。试验采用离子交换树脂脱 盐工艺，达到了理想的脱盐效果。 2 5 真 空浓 缩、喷 雾干燥 工艺 将脱苦 、脱色、脱盐后 的大豆多肽