紫色达利菊所含缩合单宁对肉牛后肠大肠杆菌抑制能力及其作用机理.ppt

紫色达利菊所含缩合单宁对肉牛后肠大肠杆菌抑制能力及其作用机理,姓名：辛海丰,紫色达利菊的一般介绍,紫色达利菊 (Petalostemun purpureum)是一种适应性极强，适口性较好，并广泛分布于北美草原上的一种豆科植物。它可以给家畜和野生动物提供了优良牧草和食物，具高度营养价值。 紫色达利菊含有较高的缩合单宁并具有极强的抗致病性大肠杆菌的能力。,缩合单宁的一般介绍,植物单宁(Vegetable Tannin) 又称植物多酚(Plant Polyphenol)， 是广泛存在于植物体内皮、根、叶、花和果实等组织中的一类多元酚化合物。缩合单宁一直被认为是饲料的抗营养因子， 但大量研究发现， 植物饲料中的缩合单宁对反刍动物营养生理具有一定的积极作用。饲料中单宁含量过高对动物有很强的抗营养作用， 但若含适量的单宁则能很好地提高动物的生产性能,缩合单宁的一般功能,1.对动物生产性能的影响 a.缩合单宁能够提高羊的毛产量 b.缩合单宁也对反刍动物的繁殖性能有一定的影响。缩合单宁能够增加绵羊的排卵数。 c.缩合单宁能够提高奶牛的产奶量 2.对动物健康的影响 a.缩合单宁有抗寄生虫的作用,一.本实验的研究目的,大肠杆菌作为兼性厌氧菌广泛存在于哺乳动物胃肠道中，大多数大肠杆菌是共生的。但有一些大肠杆菌对人体和动物具有致病性，一些大肠杆菌，如 O157:H7，能够导致出血性结肠炎，甚至造成死亡。而肉牛后肠存在大量致病性大肠杆菌，对环境和人体健康具有潜在威胁，同时随着近年来抗生素的广泛使用，导致大量抗药性大肠杆菌的产生。因此，如何有效利用利用自然药物，如一些植物提取物，抑制大肠杆菌并改善动物机体健康成为研究热点。在多酚类化合物中，水解单宁和缩合单宁具有独特的生物学活性且部分水解和缩合单宁能够有效抑制大肠杆菌或其它致病菌。但相对于水解单宁易被吸收而对动物机体造成的毒害作用，缩合单宁由于其不被动物机体吸收，因此具有良好的应用潜力，特别是对反刍动物后肠消化道致病性微生物的抑制更显重要。根据 报道，紫色达利菊根部所含缩合单宁具有较强的抗菌能力，但并无后续报道，本试验的目的是要通过体内和体外试验论证这种植物单宁对大肠杆菌的抑制作用，并结合电子显微镜观察和细胞膜通透性的测定，来简单阐述缩合单宁对大肠杆菌抑制机理。为未来利用该缩合单宁抑制致病性微生物的研究及对不同抑菌性缩合单宁的筛选提供数据。,二.研究内容,方法： 2.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响 2.2放牧条件下紫色达利菊缩合单宁对肉牛后肠发酵及后肠大肠杆菌的影响,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3. 1.1.2 缩合单宁的提取 11 种植物冻干后，称取 50g 粉碎至 1mm 的样品置于 1L 含（0.1% Ascorbic acid A-7506,Sigma）丙酮，水（70:30 v:v）抽提溶液中，黑暗中低温经组织捣碎机搅拌抽提 1h 后，将抽提物在 3000g 4下离心 30min，将上清液与等量乙醚（Diethyl ether, B14993, BDH）混合后静置 5min，分层后弃去上层有机相有机溶液，保存下层液相溶液。重复抽提一次，将两层液相混合后经旋转蒸发仪（35 120rpm, Laborota 4000 efficient, Heidolph, Germany）减压蒸发掉溶于液相的丙酮，再经氮气吹扫仪（40，OA-SYS heating evaporator 24 needles,N-EVAPTM112. USA）浓缩冻干。（确定无丙酮，否则无法冻干），冻干样为植物缩合单宁的粗提物（crude extraction）。,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3. 1.1.3 缩合单宁的纯化 冻干后的植物粗提物溶于 200ml 99%的乙醇中，然后与等比例去离子水混合，互溶后加入交联葡聚糖柱（Sephadex LH-20）中，搅拌后真空抽滤，反复加入 50%乙醇水溶液直到真空抽滤溶液无色为止，弃去滤液，然后加入 50%丙酮水溶液，反复冲洗直到滤液变为无色，滤液经旋转蒸发仪蒸干后再经氮气吹扫仪吹干后冻干，此时冻干样为纯缩合单宁，纯化后的缩合单宁在低温黑暗中保存（交联葡聚糖使用前需浸泡在 50%丙酮水溶液中）,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3.1.1.4 微生物样品的准备 非致病性大肠杆菌（25922; ATCC）和致病性大肠杆菌 O157:H7(3081 kanR )取自莱斯布里农业研究中心（Lethbridge research centre culture collection. Canada）。,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3.1.2试验设计 试验一，试验采用单因素试验设计，将 100l 致病性大肠杆菌 O157:H7（24h 培养液）加入到 95ml 培养基中，同时加入 5ml 一定浓度的缩合单宁（11 种）使终浓度为 400 g/ml。 试验二，试验采用单因素试验设计，在厌氧条件下，在含 100l 大肠杆菌（ATCC 25922）培养液中加入定量紫色达利菊缩合单宁使终浓度达到 0、 25、50、100 和 200 g/ml, 比较紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌的影响。,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3. 1.3 试验条件 1.3.1 大肠杆菌生长曲线以及微生物数量的测定 将活化后的细菌转接到经高压灭菌后的M9培养基中( (M9 Minimal Salts, Sigma ChemicalCo.)，同时每升中添加 5g 水解酪蛋白氨基酸（casamino acids），0.239g Mg2SO47H2O，3g 过滤灭菌葡萄糖（glucose）和 0.011g CaCl2)，37培养至对数期，取 100l 大肠杆菌和一定浓度的 11 种缩合单宁（溶于 M9 培养基中）加入到 95ml M9 培养基中，37振荡培养 24h。观察生长曲线。生长曲线利用培养液浓度在紫外分光光度计(UltraSpec Plus 4505, Pharmacia, QC,Canada) 600nm 吸光度折算。不含大肠杆菌的培养液调 0。同时，将活化后的大肠杆菌（ATCC 25922）转接到新鲜灭菌的 M9 培养基中，在厌氧条件下（厌氧操作在厌氧培养箱中进行，Vinyl Anaerobic Chambers, Mandel scientific companyInc., Canada），37培养至对数期，各取 100l 大肠杆菌和 250l 不同浓度紫色达利菊缩合单宁（溶于 M9 培养基中）加入到 4.65ml M9 培养基中，在厌氧条件下，37振荡培养 24h，吸光度 600 测定生长曲线（Genesys 20 Visible Spectrophotometer, Thermo scientific）。在 5ml M9培养基中缩合单宁的浓度分别为 0, 25, 50, 100, 200g/ml。24h 培养液用 PBS 梯度稀释，各取100l 涂布固体 LB 平板，每个梯度 3 块平板，37下培养 12h 后进行菌落计数。试验重复 2次。,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3. 1.3.2 大肠杆菌细胞外膜渗透性测定 方法参照 Loh B（1984）。 将活化后大肠杆菌（ATCC25922）在 M9 培养基中培养至对数生长期，10000g 收集菌体，PBS 洗涤两次后调整至 OD600 为 0.80.05。转移 190l 至黑色 96 孔板中（Costar 96-well black solid plates, Costar Inc.），加入 10l 1mmol/L NPN 荧光染色剂（NPN, Cat.no.104043. Sigma Chemical Co.），静置 5min 后，加入 50l 不同浓度紫色达利菊缩合单宁（PBS 溶解）至终浓度为 0、25、50、100 和 200g/ml。利用多功能微孔板检测系统测定，荧光检测设置为（excitation 360/40, emission 460/40）（BioTek Synergy HT, USA）。,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3. 1.3.3 细胞表面形态的观察 采用透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察表面形态。取 2.1.3.1 中大肠杆菌生长至对数生长期OD600为0.6 0.05 时，离心收集细胞后PBS洗涤两次后加入固定液固定后观察。（SEM：Hitachi S-570，TEM：Hitachi H-500）,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3.1.4结论与分析 3.1.4.1缩合单宁对大肠杆菌的影响,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3.1.4.2不同植物缩合单宁对致病性大肠杆菌生长曲线的影响 如表 3-1 所示，通过对比 11 种不同类型的缩合单宁添加量 400g/ml 对致病性大肠杆菌的影响发现，除紫色达利菊所含缩合单宁对致病性大肠杆菌有显著抑制外（P0.01），其它植物缩合单宁对大肠杆菌的抑制较小。,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3.1.4.3紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌细胞膜通透性的影响 紫色达利菊缩合单宁能够降低大肠杆菌细胞膜通透性，见图 3-2，随着缩合单宁添加量的增加，细胞膜的通透性随之降低，200g/ml 显著降低大肠杆菌 ATCC25992 细胞膜通透性（P0.01）。而 24h 培养基中大肠杆菌的数量也随着紫色达利菊缩合单宁添加量的增加而降低（P0.01）。,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3.1.4.3紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌细胞膜通透性的影响,3.1紫色达利菊缩合单宁对大肠杆菌体外纯培养及对细胞膜通透性的影响,3.1.4.4缩合单宁对大肠杆菌细胞膜的影响 如图 3-3 所示，通过扫描电镜观察， 在厌氧条件下，大肠杆菌的生长都受到紫色达利菊缩合单宁的抑制，且随着单宁含量的增加，抑制效果加强。在扫描电镜图片 A 和 B 中可以观察到完整的大肠杆菌且细胞外膜清晰无杂物。而随着培养基中缩合单宁含量的增加，大肠杆菌细胞膜表面会出现絮状膜外物质。当培养基中缩合单宁达到 200g m-1时，大肠杆菌细胞膜外出现大量絮状物，且其生长严重受