GB14934-94食(炊)具消毒卫生标准大肠菌群.ppt

大肠菌群 Coliform bacteria,1. 概念及卫生学意义,1.1概念 大肠菌群系指一群能在36 24小时内发酵乳糖产酸产气，需氧、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。包括肠杆菌科中4种常见的细菌： 埃希氏菌属、 柠檬酸杆菌属、 克雷伯氏菌属 肠杆菌属（实际上还包括产气肠杆菌） 所以，大肠菌群是作为卫生指标而选择的一类细菌。,1.2 卫生学意义,肠道传染病的传播，主要是通过粪便污染水及食品或其他物品来实现，但从这些样品中直接检查病源菌是非常困难的，也是难以做到的，主要有以下原因：,1.2 卫生学意义,病原菌在粪便中含量较多，但经过污染物品（食品和水等）的稀释，一般难以检出。 粪便中的非病原菌数量比病原菌数量大得多，即使采用强抑制性选择培养基，也无法与数量占绝对优势的非病原菌相竞争，势必影响病原菌的发育和增殖。 肠道病原菌种类较多，生物学性状也不尽相同，不可能全面检验，加之检验方法较为繁琐，设备及技术要求较高，难以普遍推广。,1.2 卫生学意义,理想的粪便污染的指标菌，应具备下列条件： （1）是人类肠道细菌丛的组成部分，在数量上占优势； （2）排出体外后，在外界环境影响下，其存活时间应与肠道致病菌大致相似或稍长； （3）检验方法简便，易于检出与计数； （4）如用作饮用水时，对氯消毒的抵抗力应不低于肠道致病菌，而且进入水中不再繁殖。,1.2 卫生学意义,在卫生细菌学检验中，可以作为粪便污染指标菌的有三类细菌：即大肠菌群、粪链球菌和产气荚膜梭菌。 大肠菌群： 数量最多； 存活时间与肠道主要病原菌大致相似； 检验方法简单易行。 故大肠菌群作为粪便污染指标菌较为适宜。,1.2 卫生学意义,在大肠菌群中，大肠埃希氏菌是人、畜肠道内的优势菌类，另外三种只占少数。但值得注意的是在腹泻患者的粪便中，肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等也是大量存在的，因此，它们也具有同样的卫生学意义。,1.2 卫生学意义,大肠菌群中4种细菌生长的适宜温度不相同。 夏季（气温3033）：优势菌是大肠埃希氏菌； 冬季（气温710）：阴沟肠杆菌； 秋季（气温2023）：大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌两者数量相近。,1.2 卫生学意义,通常可根据水中大肠菌群的数量来判断水源是否被粪便所污染，并可间接推测受肠道病原菌污染的可能性。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。,2大肠菌群检验方法,GB/T 4789.3-2003（多管发酵法） GB/T 4789.3-2008（多管发酵法） 纸片法,多管发酵法,应用范围 各类食品中大肠菌群的测定。 原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在36，24小时内能发酵乳糖产酸产气，并在选择性培养基上产生典型菌落,仪器,高压蒸汽灭菌器 恒温培养箱 显微镜 试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等。,检验程序,361 24 2h 培养,检样,稀释,乳糖胆盐发酵管,检验程序,检验程序,革兰氏阳性,革兰氏染色,大肠菌群阴性,查MPN表,乳糖发酵管 361，242h,产酸产气,不产酸不产气,大肠菌群阳性,大肠菌群阴性,报告,报告,革兰氏阴性 无芽胞杆菌,挑取可疑菌落,报告,查MPN表,查MPN表,检验步骤,发酵法采样 食（饮具抽检碗、盘、口杯，将2.0cm2.5cm（5cm2）灭菌滤纸片紧贴内面各10张（总面积50cm2）、碟、匙、酒杯以每5件为1份，每件内面紧贴灭菌滤纸片各2张（总面积50cm2/份），经1min，按序取置入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡后，制成原液。 筷：取每双的下段12cm处约50cm2（12cm 2cm 2cm），置入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡20次，制成原液。,检验步骤,用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇混匀，制成1：100的稀释液。 另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。,检验步骤,乳糖发酵（初发酵）： 分离培养： 紫黑色有金属光泽菌落，G-杆菌 粉红色和红色菌落,检验步骤,证实试验：乳糖发酵管发酵 结果报告 根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）样品中总大肠菌群的MPN值。,伊红美蓝琼脂(EMB),制法： 将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷却至5055，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。,3.2伊红美蓝琼脂(EMB),质控：此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质控菌株接种后，35 培养1824小时，观察结果应如下表：,伊红美蓝琼脂(EMB),伊红美蓝琼脂(EMB),伊红美蓝琼脂(EMB),说明： （1）本培养基为弱选择性，Difco手册第十版将配方中10g乳糖改为5g乳糖和5g蔗糖，认为效果更佳。 （2）伊红-Y又称曙红或四溴萤光素(CO2H8O5Br),为酸性染料。美蓝又称亚甲蓝(CH3)2N2C12H6NS(OH)，为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，染上红色，再与美蓝结合而形成紫黑色菌落，并有绿色金属光泽。二者除了作为指示剂外，还有抑制革兰氏阳性菌的作用。,伊红美蓝琼脂(EMB),说明： （3）在碱性环境中，不分解乳糖产酸的细菌不着色。伊红、美蓝不能结合，故沙门氏菌和志贺氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。 （4）此培养基原为Levine氏设计，用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌，并可快速鉴定白色念珠菌及凝固酶阳性葡萄球菌。美国公共卫生协会和美国细菌学会推荐，用于增殖或鉴别大肠杆菌的检查。但某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。培养基保存注意避光防止氧化。,3. 培养基,3.1乳糖胆盐培养基：,成分： 蛋白胨 20g 猪胆盐 5g 乳糖 10g 0.04%溴甲酚紫 25mL 蒸馏水 1000mL pH 7.4 分装每管10mL，并放入一个小倒管，11515min高压灭菌。,3.2 伊红美蓝琼脂,成分 ： 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 17g ， 2伊红Y溶液 20mL ， 0.65美蓝溶液 10mL ， 蒸馏水 1000mL， pH7.1,3.3乳糖发酵培养基：,成分： 蛋白胨 20g 乳糖 10g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL， 蒸馏水1000mL pH7.4,检验步骤,纸片法采样 随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘、杯等），取样量可根据大、中、小不同饮食行业，每次采样610件，每件贴纸片两张，每张纸面积25cm2，（5cm 5cm ),用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内。 筷子：