课件：酶切与电泳.ppt

实验7 质粒的酶切、琼脂糖凝 胶电泳分离DNA,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,实验目的,限制性内切酶切割出目的DNA 了解琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法,实验原理,利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围很广。,影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。,琼脂糖凝胶电泳的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。,实验仪器、材料与试剂,（一） 仪器 1. 水平式凝胶电泳槽 2. 稳压电泳仪 3. 电炉 4. 紫外检测仪 5. 台式离心机,（二） 材料 实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。,（三） 试剂 1.限制性内切酶 2. TAE电泳缓冲液(50) （pH8.0） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 4. 10DNA样品上样缓冲液 5. 琼脂糖,实验步骤,酶切体系 配制酶切体系如下: (共 20L) 质粒 16 L 10X Buffer K 2 L BamH I 1 L Pst I 1 L 轻甩并混匀后（再轻甩去除气泡）放于37水浴，酶切1.5小时。,琼脂糖凝胶制备,1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.5克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入50ml电泳缓冲液（1TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60时，加入溴化乙锭5 L (终浓度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。,6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。 7. 加入电泳缓冲液（1TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。 8.在DNA样品中加入2 L (1/10体积)的10 DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。 9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。,10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。 11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。 13 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4保存，以备下周实验用。,实验结果及讨论,对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。,Relaxed circle,Linearized form,Super-coiled form,使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a proj